ラーニングコーナー

2019/07/25

ヒト腸管オルガノイド由来単層培養系の効率的な樹立と培養

  • 用途別細胞培養

オルガノイド培養システムは、再生医療、疾患モデリング、薬剤スクリーニングにとって最先端のツールです。STEMdiff™ Intestinal Organoid KitとIntestiCult™ Organoid Growth Medium (OGM; Human) はそれぞれ、ヒトの腸オルガノイドをヒト多能性幹細胞(human pluripotent stem cells (hPSCs))やプライマリーの組織からの誘導、そしてその増殖のために使用されます。しかし、3次元であるMatrigel®に埋まっているオルガノイドは、がん細胞株Caco-2やその他の腸の細胞株が一般に使用される従来の2次元単層培養系(2D monolayer culture)に適用可能なある種の実験系やハイスループットの系に適用することが難しい可能性があります。STEMCELL Technologies社は、IntestiCult™ OGMを使って、ヒト、マウスやhPSC由来のオルガノイドを、腸上皮独特の特徴を再現し続ける2次元単層として培養する方法を開発しました。
最近の研究では、樹立したオルガノイド由来2次元の細胞単層の特徴づけを行ない、これらの腸管上皮単層の生理学的性質をCaco-2細胞株と比較することに焦点が当てられています。これを行なうために、プライマリーのヒト腸オルガノイドをCorning® Matrigel®-coated tissue cultureとTranswell®プレート上でIntestiCult™ OGM 中に播種しました。7日後、培養したものを免疫組織化学解析し、バリアの完全性について測定するために経上皮電気抵抗(transepithelial electrical resistance (TEER))を計測、そしてイオン輸送を測定するためにウッシング(Ussing)チャンバー解析を行ないました。

オルガノイド単層培養方法

腸管オルガノイドの単層培養

hPSC培養由来の腸管オルガノイド、ヒト生検、またはマウスの腸サンプルを、STEMdiff™ Intestinal Organoid KitとIntestiCult™ OGM Kitそれぞれのメーカーが供給するプロトコールに従い、Corning® Matrigel®を50%含むドームとして培養、継代を行ないました。単層培養系を樹立するために、Matrigel®のドームをGentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)によって処理することにより、7~10日経過した成熟オルガノイド培養を回収してプールしました。オルガノイドはDMEM/F-12培地で一度洗浄し、0.05% トリプシン-EDTAで処理を37°C 10分間行なうことによりオルガノイドを小さな細胞塊または単一細胞のレベルまで解離させました。細胞は再度DMEM/F-12培地で洗浄し、その後IntestiCult™ OGM (rhoキナーゼ阻害剤 Y-27632を10 μM含有)に再懸濁させました。その後細胞をTranswell® インサート、または2%の Matrigel® 試薬でプレコートされた細胞培養用ウェルに播種しました。

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FIGURE 1. Transwell® インサートにおける単層培養系樹立のワークフロー

ヒトのPSC由来の腸とドナー患者の腸から得た生検は、幹細胞集団を維持・拡大させるため、それぞれIntestiCult™ OGM を使用して3次元の腸オルガノイドとして培養。オルガノイドはその後、単層培養系樹立のため回収してIntestiCult™ OGM(10 μM Y-27632含有)中に設置したTranswell®カルチャーインサート内に播種。

実験結果

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FIGURE 2. 様々なオルガノイド由来の単層培養

(A)ヒト結腸、 (B)マウス結腸、(C) Caco-2 細胞 (P25, D21)、 (D) hPSC由来オルガノイド (H9胚性幹細胞株)の代表的な明視野(左)と蛍光イメージ(右)。 villin(緑)、E-cadherin (赤)、細胞核染色のためのDAPI(青)の免疫蛍光染色。細胞の頂上端に沿ったvillin染色は細胞の極性化、E-cadherin染色は接着結合の存在を示す。DAPI染色は上皮細胞の基底外側極付近の核の存在を示す。(スケールバーは500 μm)。

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FIGURE 3.ヒト結腸細胞単層の分化

プライマリーの腸細胞単層培養の分化を促進するために、IntestiCult™ OGM のComponent B を除去してDMEM/F-12で置換することが可能ですが、これにより幹細胞ニッチを維持する因子を取り除き、細胞増殖へと推移、さらなる上皮分化が可能になります。 (A)IntestiCult™ OGM コントロールと比較して、(B)分化した培養系では、上皮の上端の境界に沿ったvillin染色が亢進した細胞単層の外観が「敷石状(cobblestone)」と表現されるような腸細胞の成熟と極性化が進行(スケールバーは500 μm)。

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FIGURE 4. 様々なオルガノイド由来の細胞単層は、異なる細胞腫のマーカーを発現

抗MUC2抗体(緑)は腸の単層培養中のゴブレット(goblet)細胞の存在を確認するために使用。ゴブレット(goblet)細胞が存在することを示す染色陽性の像は、(A) ヒトの結腸オルガノイドと(B) hPSC (H9細胞株)由来の細胞単層の両方から得られた。 (C) IntestiCult™ OGM 中での3次元オルガノイド培養では、幹細胞ニッチが維持されており単層においては、相対的なlgr5の発現低下・MUC2の発現増加から示されるように、分化ステップが無い状況においても、より分化した状態が維持されている。(n = 3, *p < 0.01).

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FIGURE 5. オルガノイド由来の細胞単層は、高いTEER値・低いFITC-Dextran透過性を有する

細胞単層の厚さと細胞間密着結合の質を測定するには、一般的には経上皮電気抵抗値(trans-epithelial electrical resistance (TEER) )を測定します。(A)7日間IntestiCult™ OGM中で培養したオルガノイド由来の細胞単層と、DMEM/F-12(10% fetal bovine serum (FBS)含有)で21日間培養したCaco-2細胞を直接比較すると、これらの条件下ではそれぞれの細胞は同等のTEER値を示した。オルガノイド由来の細胞単層においてTEER値は平均358.5 ± 22.6 _*cm2 (SEM; n = 12)となり、Caco-2単層における平均301.1 ± 22.3 _*cm2 (SEM; n = 10)と比較して同等かそれ以上のバリア機能を持つことが示された。(B) 同様に、両培養系の培地をDMEM/F-12(2% fetal bovine serum (FBS)含有)に置換した場合にも、TEERの測定値は24時間に渡って一定に維持されました。(C)しかし、同じ実験条件においてFITC-dextranをウェル頂上に添加した場合には、Caco-2細胞では24時間の間に透過性が大きく上昇していったのに対して、オルガノイド由来の単層は優れたバリア機能を維持していた。(n = 6, * P<0.05)

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FIGURE 6.オルガノイド由来の単層は、Caco-2細胞培養と比較して優れたCFTR活性を有する

CTFRは腸上皮での液分泌の制御において鍵となるイオントランスポーターの一つであり、嚢胞性繊維症においてこの分子の機能が欠損すると、肺と腸両方に著しい合併症を引き起こす可能性があります。(A)IBMX/フォルスコリンによる活性化やCTFRインヒビター172(CFTRinh172)による阻害を行なった際のCFTR活性を、ウッシング(Ussing)チャンバーを使ってヒト腸単層とCaco-2細胞間で比較。 (B) IBMXとフォルスコリンで処理すると、 短路電流の変化(ΔISC)の分だけ活性が上昇したが、その上昇分はヒト腸の細胞単層ではISCが40.3 ± 7.62 _A/cm2 (SEM; n = 6)であり、Caco-2細胞のISC(6.7 ± 0.61 _A/cm2 (SEM; n = 4; p = 0.04))よりも有意に高い値を示しました。CFTRinh172で処理するとCTFRの活性は低下し、ヒト腸細胞単層ではΔISCが80.6 ± 5.96 _A/cm2 (SEM; n = 6)であり、Caco-2細胞培養の15.5 ± 1.98 _A/cm2 (SEM; n = 4; p < 0.0001)と比較して、腸の細胞単層では感受性が高まっていることが示されました。同様の実験をhPSC由来オルガノイドに対して行ないましたが、CFTRの活性化及び阻害に対して反応性を全く示しませんでした。

結論/まとめ

  • IntestiCult™ OGM Human は、3次元のオルガノイド培養からプライマリー細胞の細胞単層を直接樹立するために使用することができます。
  • これらオルガノイド由来の細胞単層は融合性であり、極性があり、密着結合を有しています。
  • オルガノイド由来の細胞単層には、幹細胞、腸細胞、機能的なゴブレット細胞を含む広範な細胞腫が存在しています。
  • オルガノイド由来の細胞単層は、バリア機能の維持においてCaco-2よりも優れています
  • ヒト腸細胞単層のCFTR活性はCaco-2のそれよりも優れており、活性化や機能阻害分子に対してより感受性になっています

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