STEMCELL Technologies STEMdiff STEMdiff Intestinal Organoid Kit

  • 研究用

STEMdiff™ Intestinal Organoid Kit(ST-05140)は、シンプルな3段階のプロトコールによって、ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の腸管オルガノイドを強力かつ効率的に生成できる無血清培地システムです。このキットにより、hPSCは胚体内胚葉(definitive endoderm)から中/後腸(mid-/hindgut)スフェロイドに誘導された後、腸管オルガノイドを生成します。腸管オルガノイドは、継代培養か凍結保存により長期間維持することができます。腸管オルガノイドは、発生中の腸上皮とそれに付随した間充織を模倣する細胞組成と組織化を示し、発生中の腸と直接関連性がある便利なモデルとなります。

STEMdiff™ Intestinal Organoid KitはSpence et al. (Nature 2011)が報告した組成に基づいており、複数のhPSC株にわたってオルガノイド形成・増殖の効率と再現性を高めるよう最適化されました。ヒト腸管オルガノイドは、腸の発生と細胞生物学、炎症、再生、微生物相互作用、疾患モデル化、創薬、および化合物スクリーニングを研究するためのモデル系として使用できます。このキットは、mTeSR™1で維持された細胞の分化に最適化されています。

さらなる長期培養および継代には、オルガノイド維持に必要なキット構成要素をSTEMdiff™ Intestinal Organoid Growth Medium(ST-05145)として購入可能です。

2018/05/14 12:00の製品情報

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本製品は研究目的にのみ使用し、人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないようにご注意ください。

製品の特長

STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、ヒトES/iPS細胞由来腸管(小腸)オルガノイドを樹立し維持するための無血清培地です

特長

  • RELEVANT:小腸腸管上皮および関連間葉系の発達を再現可能なモデルシステム
  • ROBUST:ヒトES/iPS細胞から腸管オルガノイドへ効率的な分化をサポート
  • CONVENIENT:継代・凍結保存することで長期維持可能の便利なモデルシステム
  • SERUM-FREE:最適化された高い再現性を示す無血清培養系

アプリケーション

  • 腸管幹細胞研究
  • 腸の発達・細胞生物学研究
  • 腸管上皮細胞再生
  • 腸内細菌の相互作用
  • 腸疾患モデリング
  • 遺伝子治療のための基礎研究
  • 創薬スクリーニング

ヒト腸管オルガノイド生成のワークフロー

(A) hPSC培養は、3段階の分化プロセスを経て進行し、ヒト腸オルガノイドを生成します。プロトコルの3日目までに、培養物は胚体内胚葉に典型的な特徴を示し、中/後腸の分化が開始されます。中/後腸の分化のあいだ(5〜9日目)、細胞は中/後腸スフェロイドを形成し、細胞単層から培地に放出されます。これらのスフェロイドを回収し細胞外マトリックスに埋め込みます。
(B) 埋め込まれた中/後腸スフェロイドは、腸オルガノイドに成熟します(括弧内の日数は、各継代に埋め込まれた後の日数)。一度確立されると、腸オルガノイドは7〜10日ごとに継代することにより、培養で維持および拡大することができます。複数の継代の後、オルガノイドは一般的にマトリックスドーム内での沈み込みがより少なく、間葉系細胞の割合が低くなります。

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データ

ヒト腸管オルガノイドの構造

STEMdiff Intestinal Organoid Kitでヒト多能性幹細胞から形成された3継代目の小腸オルガノイドです。極性化した上皮単層に囲まれた中空の内腔とそれに付随する間葉系細胞集団から構成されています。

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複数のヒト多能性幹細胞株にわたり、安定的に分化と増殖をサポートします

STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、ヒトES細胞(H9、H7)とiPS細胞(WLS-1C、STiPS-MOO1)の両方から腸オルガノイドを高効率で生成できます。
(A)さまざまな細胞株由来のオルガノイドは、分化3日目にFOXA2とSOX17の共発現が示すとおり胚体内胚葉に効率的に誘導されます。
(B)ESおよびiPS細胞由来の培養物はどちらも、中/後腸誘導時に効率的なスフェロイド形成を示します。各回の分化でウェルごとに得られたスフェロイドの総数を示しています。
(C)ESおよびiPS細胞由来のオルガノイドは、複数の継代にわたって拡大および維持することができます。継代あたりの総細胞収量を示しています。オルガノイドは7〜10日ごとに、分割比1:2~1:4で継代されました。データは3回の生物学的複製の平均値で表しています。エラーバーは、平均の標準偏差を表します。

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中/後腸スフェロイドの特徴

(A)STEMdiff Intestinal Organoid Kitを使用して分化した培養物は、胚体内胚葉および中腸/後腸への特異化において予想されるマーカーを示します。遺伝子発現パターンは、多能性マーカー(0日目)から、3日目までに胚体内胚葉マーカーに、9日目までに中腸/後腸上皮に移行します。中腸/後腸培養(9日目)は、付随する間充織のマーカーも発現します。マーカーレベルはRT-qPCRによって評価され、未分化H9細胞の発現レベルに正規化されました。
(B)中腸/後腸スフェロイド(9日目)は、腸上皮のマーカー(CDX2、E-カドヘリン、EPCAM)を発現します。
(C)中腸/後腸スフェロイド(9日目)には、付随する間葉(ビメンチン)の成分が組み込まれています。

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腸オルガノイドは小腸上皮の特徴を示します

(A)分化したhPSC由来の腸オルガノイドは、腸上皮および付随する間葉のマーカーを発現します。マーカーレベルはRT-qPCRによって評価され、未分化H9細胞の発現レベルに正規化されました。
(B、C)腸オルガノイドは、CDX2を含む腸前駆細胞マーカーおよび腸陰窩マーカーSOX9を発現します。オルガノイドは極性化した上皮で構成され、EPCAMがオルガノイドの外(基底外側)表面に局在することで視覚化され(B)、MUC2(B:杯細胞)やCHGA(C:腸内分泌細胞)を含む成熟細胞型に典型的なマーカーを発現します。
(D、E)腸オルガノイドにはデスミン(D)とビメンチン(E)が観察され、間葉系細胞の取り込みを示します。一方、KRT20(D)とKi67(E)はそれぞれ分化した腸細胞と推定腸幹細胞のマーカーです。画像は、P28(7日目)でホールマウント免疫蛍光染色された腸オルガノイドのデジタル断面図です。

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mTeSR™ Plusで維持培養されたヒト多能性幹細胞から生成した腸オルガノイド

ヒトES細胞(H9)をmTeSR™ Plusで培養し、STEMdiff™ Intestinal Organoid Kitで腸管オルガノイドに分化させました。腸上皮マーカーのEpCAM(緑)とCDX2(赤)、間葉マーカーのビメンチン(白)、およびDAPI(青)で対比染色した核を示しています。

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技術資料

製品関連文献

よくある質問

STEMdiff Intestinal Organoid Kitで作製した腸オルガノイドのマーカー発現についてチェックすべきマーカー、経時的発現変化などに関するデータはありますか?

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STEMdiff Intestinal Organoid Kitで作製した腸オルガノイドのマーカー発現が、継代3回ほど過ぎると低下してしまいます。細胞維持はオルガノイドの状態でおこなっています。オルガノイドの品質維持におけるコツなどはありますか?

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STEMdiff Intestinal Organoid Kit(ST-05140)で検証されているiPSC株は?

WLS-1C、STiPS-M001の2つのiPS細胞株で検証されています。

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