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2018/08/29

ヒトES/iPS細胞から長期培養可能な「ミニ腸」オルガノイドを効率的に!

  • 用途別細胞培養

ヒト多能性幹細胞(ヒトES/iPS細胞、hPSCs)は、疾患モデル、ドラッグスクリーニングおよび再生医療に対して非常に重要なツールです。
最近の研究により、ヒトES/iPS細胞は発達においてシグナル伝達経路を模倣することで、組織特異的な細胞へ分化できることが示されています。
分化の特定段階における成長因子のタイミング、持続時間および濃度が、細胞の運命や細胞系列へ分化決定の重要な要因になります。

STEMdiff Intestinal Organoid Kit 概要

ヒトES/iPS細胞からヒト腸管オルガノイド(Human Intestinal Organoids:HIOs)への分化・形成を標準化するために、STEMCELL Technologies社は、Jason Spenceら(Spence et al., Nature. 2011 Feb 3;470(7332):105-9)のin vitroでHIOsへ分化・形成するプロトコールに改良を加え、STEMdiff Intestinal Organoid Kit(製品コード:ST-05140)を開発しました。
STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、ヒトES/iPS細胞から3段階(1. 体内胚葉、2. 中/後腸、3. 小腸)への分化を促進する、効率的で再現性が高い無血清培養系です。

ヒト腸の発達と内胚葉の器官形成

Zorn & Wells, Annu Rev Cell Dev Biol. 25: 221-251

STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、未分化ヒトES/iPS細胞の中内胚葉の重要な段階を経て、効率的に胚体内胚葉へ誘導・形成し、さらに中胚葉および後腸前駆細胞を生じる後方内胚葉を形成します。これらの前駆細胞は、重要な転写因子Caudal Type Homeobox Protein 2(CDX2)を発現し、さらに分化すると小腸細胞に成熟します。

プロトコールおよび分化段階における形態変化

STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、30日間以内でヒト腸管オルガノイドを形成が可能な効率性で再現性が高い無血清培地です。他のプロトコールと比較して、ヒトES/iPS細胞株を問わずHIOsの形成を促進できます。ヒトES/iPS細胞由来HIOsは、STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium(商品コード:ST-05145)を用いて長期培養(>11 month, n=3)・増殖し、凍結保存も可能です。

フロー図

2Dモノレイヤーの分化過程における形態変化

次の4段階の過程で行われます。

  1. スフェロイドを形成・出芽
  2. スフェロイドを回収
  3. Corning® Matrigel®ドームに埋め込み
  4. さらにHIOsへ分化
フロー図

データ例

中/後腸マーカー(CDX2)の発現を誘導

STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、効率的に中/後腸マーカー(CDX2)の発現を誘導します。

免疫染色による解析

中/後腸マーカー:CDX2、上皮マーカー:E-カドヘリン、間葉系細胞マーカー:ビメンチン

イメージ図

分化した中/後腸モノレイヤーの定量分析

分化した中/後腸モノレイヤーの定量をフローサイトメーターで分析しました。
複数のES細胞(H9、H7)、iPS細胞(WLS-1C、STiPS-M001)株において、後方内胚葉マーカー(CDX2)が発現上昇した一方で、前方前腸マーカー(SOX2)が発現していないことを示します(mean±SD, n≥2)。

グラフ

3Dスフェロイドへ効率的に形成・出芽

STEMdiff Intestinal Organoid Kitにより、2Dモノレイヤーの中/後腸から効率的に3Dスフェロイドへ形成・出芽します。

8日目で浮遊後腸スフェロイドを有するモノレイヤー

イメージ図

4~11日目で分化したスフェロイドの定量分析

細胞株:STiPS-M001;mean±SD

グラフ

出芽形成の例

WLS-1C細胞から分化して8日目のオルガノイドの画像
左:接着後腸スフェロイド
右:定量分析のために、懸濁液状態にしたスフェロイド

イメージ図

テストした4種類の細胞株は、中/後腸スフェロイド形成する可能性を示すヒトES/iPS細胞株分化の内在的差による出芽の違いがみられます。

グラフ

リリースされた中/後腸スフェロイドへ分化9日後の免疫染色解析

スフェロイドの偏極上皮マーカー(CDX2、E-カドヘリン、EpCAM)を発現

イメージ図

間葉系細胞マーカー(ビメンチン、CDX2)も発現

イメージ図

腸・間葉系細胞の重要なマーカーを発現

ヒトES/iPS細胞由来のHIOsは、STEMdiff Intestinal Organoid Kitで早く増殖し、腸・間葉系細胞の重要なマーカーを発現します。

ヒトES/iPS細胞由来のHIOs 形態

ヒトES/iPS細胞由来のHIOsは、出芽形成を伴う厚壁の偏極上皮構造の表現型および中央の中空な内腔を取り囲む薄壁上皮の嚢胞性のオルガノイド形態を示します。

イメージ図

ヒトES/iPS由来腸オルガノイドの増殖速度

STEMdiff Intestinal Organoid Growth Mediumで培養した複数のES細胞(H9、H7)、iPS細胞株(WLS-1C、STiPS-M001)由来HIOsの増殖速度(mean±SD, n=3)。

グラフ

分化した腸オルガノイドのマーカー発現

28~110日間分化したHIOsは、腸管上皮・間葉系細胞の重要なマーカーを継続的に発現します。いずれもqPCRのデータ(mean±SD, n=1)。

グラフ

免疫染色による解析

H9 ES細胞から分化193日目の免疫染色解析。
HIOsは腸細胞・杯細胞・腸内分泌系特異マーカー(CDX2, MUC2, EpCAM, KRT20, GATA4, SOX9, CHGA)および間葉系細胞マーカー(デスミン、ビメンチン)を発現していました。また、Ki67遺伝子の発現により、細胞の多能性および推定腸管幹細胞の存在(オルガノイド長期培養の可能性)を確認できます。
350日以上維持培養した後に1か月間凍結保存したHIOsは性能を回復し(n = 3)、再びSTEMdiff Intestinal Organoid Growth Mediumで培養可能です。

イメージ図
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