ラーニングコーナー

2019/06/24

幹細胞におけるCRISPR-Cas9ゲノム編集および、脳オルガノイドの形成

  • 用途別細胞培養

ヒト多能性幹細胞(human pluripotent stem cells: hPSCs)を用いたヒト疾患のモデリングは、CRISPR-Cas9によるゲノム編集と 組み合わせる事により、病理メカニズムの研究における重要な戦略となってきています。
本ページはDr. Lancasterらの研究成果をまとめたものです。私たちは原発性小頭症の発症に関与する遺伝子であるCDK5 regulatory subunit-associated protein 2 (CDK5RAP2)C末端欠失型を有するクローンを作製するため、ArciTect CRISPR-Cas9 systemを使用しました(Lancaster et al, Nature 2013)。私たちはSTEMdiff Human Cerebral Organoid Kit(ST-08570)を使っての大脳オルガノイド形成させるために必要な、細胞の品質特性(核型、多能性、形態、およびマーカーの発現)によりさらに特徴づけられた安定なクローンを生み出す事に成功しました。

研究概要

  • ゲノム編集、細胞品質のチェック、およびArciTect CRISPR-Cas9 systemを用いた安定なゲノム編集クローンの作製のワークフローを確立しました。
  • CDK5RAP2のトランケーション(欠失)は、有糸分裂の際、(通常は紡錘体に局在する)CDK5RAP2に誤った局在化を引き起こします。
  • CDK5RAP2がC末端欠失型になっているクローンからは、コントロールのものに比べて小さい大脳オルガノイドが発生し、Lancasterらのデータに類似した神経マーカー発現の増加と神経前駆細胞マーカー発現の減少がみられます。

実験方法

Organoid1

A)ArciTect CRISPR-Cas9リボ核タンパク質は、CDK5RAP2を標的とするガイドRNAと複合体を作ることにより形成され、血液由来のhPSC株(STiPS-B004)にエレクトロポレーションにより遺伝子導入されました。トランスフェクションした細胞は37℃で3日間、mTeSR1 + CloneR中でインキュベートしました。単一細胞分離後には、細胞を10 cm2ディッシュあたり400個の密度で播種して37℃で3日間、mTeSR1 + CloneR中でインキュベートしました。

培地の全量交換はmTeSR1で行い、細胞をその後さらに5日間インキュベートしました。その後単一クローンを選択し、24ウェルプレートで7日間、mTeSR1中で増殖させました。最初の継代の際には、ゲノムDNAを精製してCDK5RAP2の遺伝子座領域をPCR(polymerase chain reaction)により増幅し、サンガーシークエンシングによりそのPCR産物において遺伝子編集の有無を確認しました。

選択した約24クローンのうち、中途停止コドンを生じるフレームシフト変異をヘテロで有するクローンが2,3個選択されました。CRISPR-Cas9による遺伝子編集の第二段階では、(黒矢印で示されるように)これらのヘテロクローンを使って、CDK5RAP2の両アレルに中途停止コドンを生じる変異を有する複合ヘテロクローンを作製しました。

B) クローンは全て、ReLeSR(ST-05872)を使用してclumps passage(継代)を行い、、mTeSR1中で増殖させました。クローンはさらに、次のような形質・機能解析により特徴を同定しました;G分染法による低解像度での核型の確認(p5で実施)、hPSC Genetic Analysis Kit(ST-07550)を用いた9つの遺伝子座における高解像度での核型異常スクリーニング(p5、p8、p10で実施)、STEMdiff Trilineage Differentiation Kit(ST-05230)による分化能の確認(p5に実施)、マーカー分子OCT4の発現確認(p1、p5、p10で実施)と細胞の形態評価。p6-p10の時期で行うヒト大脳オルガノイドの作製には、CDK5RAP2のC末端欠失を有する安定な遺伝的クローンを使用しました。

C)大脳オルガノイドはSTEMdiff Cerebral Organoid Kitを用いて作製しました。RNAはDay 5、7、10、および18で抽出し、RT-qPCRにより神経マーカー(DCXとTUJ1)、神経前駆細胞マーカー(PAX6とSOX2)の発現を解析しました。Day18には、オルガノイドの凍結切片を作製してPAX6とTUJ1について免疫染色を行いました。

実験結果

Organoid2.png

FIGURE 2.  ArciTect CRISPR-Cas9ゲノム編集による、CDK5RAP2での中途停止コドン

A)CDK5RAP2の一次配列。原発性小頭症に関与する疾患変異はで示され、タンパク質-タンパク質相互作用領域灰色)と中心体結合ドメイン緑)はC末端に見られます。Box部分:設計されたガイドRNAの一次配列はオレンジでハイライトされています。

B)オフターゲット遺伝子編集については、CDK5RAP2を標的として設計されたガイドRNAに対して、オフターゲットサイトとなる可能性が予測される遺伝子座にサンガーシークエンシングを行うことにより、その有無を決定しました。その結果、解析を行った遺伝子座にはオフターゲット編集が起こっていない事を確認しました。ミスマッチ塩基はでハイライトしています。

C)コントロール、ヘテロ、複合ヘテロの各細胞株でサンガーシークエンスを行い得られたDNA及びアミノ酸配列情報。これにより、フレームシフトと中途停止コドンが生じる2塩基対欠失、4塩基対欠如がそれぞれのヘテロにおいて、存在することが判明しました。

Organoid3.png

FIGURE 3. 遺伝子編集されたCDK5RAP2クローンはhPSCとしての形態と多能性を示す

A) ヘテロ及び複合ヘテロの安定なhPSCクローンの代表的な位相画像形態はコントロール細胞株由来のhPSCと同様、多層で高密度に充填されています。

B) hPSC コロニーの核はDAPI(灰色)で示しています。

C)クローン細胞株は未分化細胞マーカーOCT4 (OCT3)(緑色)を発現していました。

D)各クローン細胞株の分化能を、STEMdiff Trilineage Differentiation Kitを使って評価しました。全てのクローン細胞株は外胚葉(PAX6陽性)、内胚葉(SOX17陽性)、中胚葉(Brachyury陽性)への高い分化能を示しました。

Organoid.png

FIGURE 4. 遺伝子編集されたCDK5RAP2クローンは遺伝的な安定さの確認

A)5回目の継代において、コントロールと遺伝子編集された細胞株の核型は正常な二倍体を示しています。倍数性は、hPSCの典型的なバックグラウンドレベル(<10%)と比較して、ヘテロ、複合ヘテロ両細胞株で上昇がみられます(ヘテロ:~20%、複合ヘテロ:~33%)。これは、分裂中期や細胞質分裂の際の染色体分離で潜在的なエラーが起こっている可能性を示しています。

B)遺伝子編集された細胞株を、9個の遺伝子座における再発性の核型異常についてスクリーニングしました。スクリーニングされた細胞株はすべて、p5p10においては正常な倍数体コピー数を示していました。

Organoid4.png

FIGURE 5. 複合ヘテロクローンでは細胞分裂の間CDK5RAP2が誤った局在となるが、hPSCの増殖率には影響なし

A)コントロールおよびヘテロの細胞では、分裂中期に入ったhPSCCDK5RAP2(紫)がアクチン(緑)で示される紡錘体の各極に存在する独特の局在パターンになります。核はDAPI(灰色)で示されています。複合ヘテロではCDK5RAP2(紫)の紡錘体への局在は見られません。

B) hPSCにおけるCDK5RAP2の転写産物についてのRT-qPCR解析では、コントロールやヘテロに比べて複合ヘテロでCDK5RAP2の転写産物の発現の低下が見られました(データポイントあたり3つのタイムポイント(n=3)、平均+/- SEM、コントロールを基準に正規化;複合ヘテロとヘテロを比較した際、P ≤0001)

C)すべてのクローン細胞株において、hPSCの増殖率に有意な差はありませんでした(データポイントあたり3つのテクニカルレプリケイト(n=3)、平均+/- SEMP > 0.05)。

Organoid5.png

FIGURE 6. CDK5RAP2は大脳オルガノイドのサイズを減少させ、Day18でマーカー発現に影響を与える

A)オルガノイド形成の各ステージにおけるhPSC由来オルガノイドの代表的な位相差画像。

B) オルガノイド形成の各ステージにおける面積測定(μm2) では、すべてのステージにおいてCDK5RAP2複合ヘテロにおいてコントロールに比べてサイズ減少が見られます(n=4、データポイントあたり12-16個のオルガノイド、平均+/- SEM;コントロールと複合ヘテロ型の比較においてP ≤05)。

C)大脳オルガノイド形成の各ステージのオルガノイドにおけるRT-qPCR解析により、Day18での神経前駆細胞マーカー(SOX2PAX6)、神経マーカー(DCXTUJ1)の発現が複合ヘテロとコントロールで違いがあることが示されました(n=4、データポイントあたり12-16個のオルガノイド、平均+/- SEM、コントロールを基準に正規化;ns: P > 0.05, *: P ≤ 0.05, **: P ≤ 0.01)。

D)Day18のオルガノイドの免疫染色により、複合ヘテロクローンでは皮層においてコントロールやヘテロクローン細胞株に比べて神経マーカーのTUJ1 (緑)の発現が亢進、神経前駆細胞マーカーPAX6 (紫)の発現が減少していることが示されました。脳室帯様の領域は白の破線で示しています。

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