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2019/07/22

ES/iPS細胞培養におけるシングルセル継代の課題

  • 用途別細胞培養

ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を含むヒト多能性幹細胞(ES/iPS)(hPSC)は、自己複製能と様々な細胞に分化する能力(多分化能)を持つため、臨床、創薬および、再生医療への応用において非常に大きな可能性を秘めています。従来のヒト多能性幹細胞培養法は、フィーダー細胞(マウスまたはヒトの線維芽細胞のような)層の上で培養されていました。 近年よく利用されているフィーダーフリー培養は、フィーダー細胞を使わず、代わりに細胞外マトリックス(Corning Matrigel®)、または最近ではさまざまな組み換えタンパク質(Laminin, Vitronectinなど)および合成基質のいずれかが利用されています。 フィーダー細胞の有無やマトリックスの違い他に、継代方法としてシングルセル継代、クランプ継代の違いもあります。本ページではシングルセル継代の課題に関しての議論をまとめました。

シングルセル継代での課題

シングルセル継代での課題

  • シングルセル継代法により、核型異常を引き起こしたクランプをシングルセル化して継代するのは、その後のすべての培養にコンタミするリスクが高い
  • シングルセル剥離試薬(Trypsin TryPLEおよびAccutase)による核型異常の増加
  • シングルセル化での剥離及びその後の低密度での再プレーティングは、細胞損傷および細胞死(アポトーシス)を引き起こす
  • クランプ(クラスター)継代では細胞形態(Morphology)による細胞品質評価が可能だが、シングルセル継代ではそれが難しい

ES/iPS細胞培養/継代概要

ES/iPS細胞:シングルセル継代 vs. クランプ継代概要

ES/iPS細胞培養の継代操作による、二つ継代法(クランプ継代とシングルセル継代)に分かれています。

0722(1).png図1  クランプ継代の細胞形態

0722(2).pngシングル継代の細胞形態

ES/iPS細胞は、クランプ継代(すなわち、コロニーを小さい細胞塊に切断し、継代する法)技術により通常コロニーとして培養されます。

単層培養でのシングル継代法(完全に解離したシングル細胞懸濁液の使用)は、より増殖が速く、多くの細胞が得られるという利点を有すると言われています。しかし、ES/iPS細胞のシングルセル剥離操作は、長期培養時にES/iPS細胞にゲノム変異を引き起こすことが示されています(Bai Q, et al.,2015; Garitaonandia I, et al. 2015)。

シングルセル継代法は核型異常細胞を継代する可能性が高い

ES/iPS細胞はクラスター継代でもシングルセル継代でも核型異常を引き起こしますが、問題はその核型異常を引き起こした細胞がどのように継代されるかにあると考えられています。

下記の模式図(B)のようにシングルセル継代では、核型異常を引き起こしたクランプがシングルセル化されて継代されるため、ほとんどすべての培養系にコンタミ(継代)されます。その培養方法からわかるようにその核型異常を引き起こした細胞が継代の際に容易に(除去される事なく)継代され、数回の継代でそれらがdominantな細胞になります。

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図3(A)<クランプ継代の模式図> 

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(B)<シングルセル継代の模式図>

赤:遺伝子変異細胞(クランプ);〇:クランプ; :シングルセル

シングルセル継代による、核型異常など

シングルセル継代による、遺伝子的異常の増加

継代の際に、ES/iPS細胞を細胞塊もしくはシングルセルとして解離させるために、各種剥離酵素、セルスクレーパーおよび、他の継代ツールなどの様々なアプローチが開発されました。

Geritaonandiaらの研究では、ヒトES/iPS細胞のシングルセル継代(Accutaseでの酵素剥離)が、クランプ継代(機械的剥離)と比べて、より高い頻度の遺伝子重複(complex CNVs)や欠失(regions of loss of homozygosity (LOH))が観察される事がわかりました

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2クラスター継代に比べて、シングルセル継代の方が明らかに早い段階で核型異常の獲得し、その数も多い事がわかる(紫)MefMech:クランプ継代;(赤)EcmMech:クランプ継代;(緑)MefEnz:シングルセル継代;(青)EcmEnz シングルセル継代(Garitaonandia I, et al. 2015よりFigureの抜粋)。

ヒトES/iPS細胞をシングルセルとして継代することは可能ですが、細胞集団に望ましくない選択圧をかける可能性があり、遺伝的異常をもたらす可能性があると言われています(Draper JS et al. 2004, Andrews PW et al. 2006, Bai Q et al. 2015)。

したがって、ヒトESまたはiPS細胞のシングルセル継代を行う場合は、核型を頻繁にチェックして、細胞が正常な核型を保持していることを確認する事が重要になってきます。

Baiらの研究では、酵素で剥離でのシングルセル継代は、限られた期間だけ使用された場合でも、ES/iPS細胞のゲノムにとって非常に有害であり得ることを示しています。

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図4酵素で剥離したシングルセルの継代培養におけるゲノム異常獲得が速い

(A)酵素での継代(Enzymatic passage, EP)または、機械的な継代法(Mechanic passage, EP)におけるヒトES細胞(hESC)のゲノムコピー数変異(CNV)。

示された継代数でEP(茶色の三角)または、MP(青色の四角)法で継代培養された3つのhESC株における、CNVを有するセグメントの総数(上のパネル)および、長さ(下のパネル)。(Bai Q, et al.,2015よりFigureの抜粋)

さらに、分化またはトランスフェクション実験では、TryPLEおよびAccutaseをES/iPS細胞のシングルセル化する事が殆どですが、その生存率が低いと核型が異常になることがよくあると報告されています(Beers J. et al. 2012)。

また、トリプシン(Trypsin)を用いてヒトES細胞をシングルセルに解離させると、最初の5〜10継代の間にプレーティング効率が劇的に低下し(<3%)、30継代後に出現する新たな亜系統が検出可能な核型異常を通常に獲得する事も報告されています(Hasegawa et al., 2006)。

シングルセル剥離による細胞の損傷

ES/iPS細胞をシングルセルに剥離し低密度で再プレーティングさせると、細胞損傷および細胞死(アポトーシス)が引き起こされるという報告(Amit, M. et al. 2000; Mitalipova, M. M. et al. 2005; Watanabe, K. et al. 2007; Ohgushi, M. et al. 2010; Beers, J. et al. 2012)があります。

ES/iPS細胞継代をシングルセルに剥離させて行うと、酵素は細胞表面タンパク質を消化することによって細胞損傷を誘発する可能性もあります(Mitalipova, M. M. et al. 2005; Beers, J. et al. 2012)。

細胞の一様な分布および均一な処理を達成するためのシングルセル培養法では、継代する時に細胞をシングルセル化しますが、hPSC(ES/iPS)細胞の場合にはシングルセル化すると細胞の生存率が低いと言われています。

これらの細胞はシングルセル化処理に対してより敏感であり、細胞死を起こしやすいという原因です(Beers J. et al. 2012)。Chen G.らのグループはシングルセル化した細胞死のメカニズムを研究し、ミオシン-アクチン(myosin-actin)依存性収縮が細胞死をもたらすこと、および収縮を阻害することによって細胞-細胞接着が細胞生存率を促進することを発見しました。また結果としてシングルセル継代では細胞密度が生存率に影響する事を明らかにしました。

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図5シングルセル解離後の密度依存的細胞生存率の経時変化

異なる数のヒトES細胞を各ウェルにプレーティングした(3,000/cm2(3K−青色の菱形、10,000/cm2

「生存指数」は、生存細胞数を播種細胞数で割ったものを表す。 (細胞が分裂するにつれて、この指標は最終的に100%を超える可能性がある)Chen G et al., 2010

シングルセル培養では形態(Morphology)での細胞品質の評価が難しい

細胞形態(morphology)は細胞品質の敏感な指標であり、細胞形態での細胞品質の評価、モニタリングも重要と言われています。シングルセル継代で培養された細胞の形態は、細胞品質の評価が困難ですが、クランプ継代では培養された細胞形態(コロニーの形、S/Nなど)により、容易な細胞品質も可能になります。

STEMCELL Technologies社が考えるES/iPS細胞の良い形態

  • 丸く、packされた状態
  • 核質の割合(S/N)が多い
  • コロニーのエッジがスムーズ
  • コロニーの中心部はマルチレイヤ―になっており、顕微鏡下ではBrightな状態
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図6クランプ継代とシングルセル継代で培養されたiPS細胞の形態

(左)クランプ継代の望ましい形態、(中)クランプ継代の望ましくない形態、(右)シングルセル継代での細胞形態

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図7クランプ継代での細胞形態スコアリング(Morphology Scoring)

望ましい形態(黄色)、望ましくない形態(黒色)

※STEMCELL Technologies社の基準でのスコアリング

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