ラーニングコーナー
2020/09/01
COVID-19研究ツール オルガノイド研究
- 細胞分離
- 用途別細胞培養
ウイルス感染症の新しい診断・治療法やワクチンの開発を目指す研究に活用いただけるよう、オルガノイド関連研究のツールをご紹介します。
COVID-19パンデミックの原因である新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の研究が世界中で進められています。STEMCELL Technologies社では、新型コロナウイルス感染症に関する科学的発見を加速するために役立つ高品質な研究用ツールをご提供しております。
COVID-19の関連製品に関しては「COVID-19研究ツールまとめ（STEMCELL Technologies社）」へ
肺ALI培養及び肺オルガノイドを用いた呼吸器疾患研究
コロナウイルスの気道感染モデル
コロナウイルス（CoV）は、SARS-CoV-2ウイルスによって引き起こされるCOVID-19を含む、一般的な風邪から重度の呼吸器疾患までさまざまな病気を引き起こすウイルスの大きなファミリーです。SARS-CoV-2の細胞侵入受容体は最近、独立した研究グループによってアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）であることが確認されています。これは、2003年にSARS流行を引き起こしたSARS-CoVの侵入受容体と同じです（文献1, 2）。
詳細に関しては「 肺ALI培養及び肺オルガノイドを用いた呼吸器疾患研究まとめ」へ
参考文献
腎臓オルガノイドを用いた感染症モデル
コロナウイルスの腎臓感染モデル
成人の腎臓は障害や損傷に応じて自己修復しますが、腎形成はヒトの胎児発生の38週までに完了し、成人の腎臓幹細胞に関しての知見はあまりありませんでした。これにより、ヒトの腎臓の研究に関してはin vitroにおける培養が難しく、動物のモデルとヒトの腎臓では関連性が限られているために困難を極めておりました。
ヒト多能性幹細胞（hPSC）に由来する腎臓オルガノイドは、発達中のヒト腎臓の構造と細胞および分子構造をモデル化します（図1）。生体内腎臓と同様に、腎臓オルガノイドは、SARS-CoV-2の結合受容体として広く認識されているACE2と、ウイルスタンパク質のACE2への結合を活性化するTMRPSS2を発現します。さらに、SARS-CoV-2感染と感染性の子孫を形成する複製は、hPSC由来の腎臓オルガノイドで実証されています。
hPSCとの分化中、腎臓オルガノイドは、発達中のヒトネフロンの構造とセグメンテーションに似た複雑な管状構造を形成します（図1）。これらのオルガノイドには、近位尿細管と遠位尿細管の内皮細胞、間葉細胞、有足細胞、上皮細胞が含まれます。オルガノイドは親細胞の遺伝子型と表現型を保持しているため、患者由来の細胞または分化前のhPSCのCRISPR-Cas9遺伝子編集を通じて特定の変異を導入することも可能です。さらに、腎臓オルガノイドは96ウェルおよび384ウェル形式で増殖できるため、薬物などの有効性と腎毒性の潜在的な治療法のハイスループットスクリーニングが可能となります。
図１．腎臓オルガノイドは典型的なネフロンのようなセグメンテーションで複雑な管状構造を形成する
(（A）分化中、腎臓のオルガノイドは、発達中のネフロンの構造とセグメンテーションに似た複雑な管状構造を形成します。 これらのオルガノイドは、ポドカリキシン（PODXL）、ハステトラゴノロブスレクチン（LTL）、およびE-カドヘリン（ECAD）を含む（B）腎上皮のマーカー、ならびに（C）内皮（血小板内皮細胞接着分子、CD31）のマーカーを発現します ）、および（D）間充織（ビメンチン、VIM; Meisホメオボックスファミリー、MEIS1 / 2/3）。
参考文献
SARS-CoV-2がヒト尿細管腎細胞に直接感染できるかどうかを判断するために、Monteilらは、腎臓オルガノイドを生成し、その後、SARS-CoV-2に感染させました。 彼らは、SARS-CoV-2が腎臓オルガノイドで複製され、感染性の子孫ウイルス粒子を生成することを発見しました。 また、ヒト組換え可溶性ACE2は、ヒト腎臓オルガノイドのSARS-CoV-2感染を有意に減少させることも確認しました。
STEMdiff™Kidney Organoid Kit製品紹介
STEMdiff Kidney Organoid Kit （ST-08605）
STEMdiff Kidney Organoid Kitは、シンプルな2段階の分化プロトコールで、ヒト多能性幹細胞（hPSC）由来の腎臓オルガノイドの高効率で再現可能な無血清細胞培養培地です。 これらの腎臓オルガノイドは、有足細胞、近位尿細管、遠位尿細管、ならびに関連する内皮系および間葉系の細胞によって構成されています。
ウェビナー：Re-Creating Disease with Kidney Organoids and CRISPR
STEMCELL Technologies社が提供するウェビナーです（視聴にはSTEMCELL Technologies社のホームページ上でのログインが必要です）。
＜演者＞Dr. Benjamin Freedman（University of Washington）
＜内容＞腎臓オルガノイドとCRISPR-Cas9ゲノム編集を使用して疾患を再作成する方法の概要を説明します。 フリーダム博士は、Brighamの腎部門とHarvard Medical SchoolのWomen’s Hospitalにおいて博士研究員として、ヒト多能性幹細胞（hPSC）を用いたネフロンを含む腎臓オルガノイドの分化やCRISPRによるノックアウト変異用のオルガノイド作出などの革新的な技術を開発しました。このウェビナーでこれらに関してご紹介いたします。
腸オルガノイドを用いたウイルス感染メカニズムの研究
腸管上皮の感染モデルに最適なオルガノイド培養
腸オルガノイドの作成技術が確立されたことにより、腸上皮組織のin vitro研究利用が可能となりました。腸オルガノイドは、腸上皮の細胞構成をin vitroで再現し、親細胞の遺伝子型と表現型を保持します。この方法は、以前はin vivo実験、不死化細胞株、または初代腸細胞の短期培養では不可能であった新しい実験を可能としてきました。
下図ではSARS-CoV-2ウイルス受容体タンパク質であるACE2を頂端上皮表面で発現させることに加えて、腸のオルガノイドはSARS-CoV-2ウイルスに容易に感染し、感染性の子孫となることが示されています。これにより、COVID-19に対抗する治療薬の開発中の両方で、SARS-CoV-2の病因を研究するためのモデルシステムを提供可能なことを示しております。
腸のオルガノイドは、通常、その頂端面がオルガノイドの内部/管腔表面上にあるように分極されていますが、オルガノイド由来のモノレイヤーとして2D培養すると、頂端面と側底面の両面に対して検討することができます。オルガノイド培養システムのこの変更により、SARS-CoV-2を含むウイルス粒子や細菌細胞と腸上皮との相互作用の研究が容易になりました。これらのオルガノイド由来のモノレイヤーは、気液界面（ALI）でエアリフトして、上皮のさらなる分化を行うことができます。 ACE2の発現は、オルガノイド由来の単層で観察され、頂端表面への強い局在が見られます（下図）。
腸オルガノイド由来のモノレイヤーは頂端表面でACE2を発現する
腸オルガノイドは、IntestiCult™Organoid Growth Medium（Human）で成長させ、オルガノイド由来のモノレイヤーを作成するために播種いたしました。（左）オルガノイド由来の液中のモノレイヤーと、（右） ALI培養されたオルガノイド由来のモノレイヤーの免疫蛍光染色は、頂端表面でのACE2の強い染色を示しています。 スケールバー= 100μm。
IntestiCult™を使用したコロナウイルスの研究
オランダのClevers and Haagmans研究所の研究者らは、in vitroでのSARS-CoV-2ウイルスの感染と複製のモデルとして、ヒトの小腸オルガノイドを使用しています。 SARS-CoVとSARS-CoV-2の両方が腸のオルガノイドに感染し、感染性の菌種を生成することが示されました。
研究者は、健康なヒトの小腸および大腸のオルガノイドを使用して、SARS-CoV-2が腸上皮細胞に感染して複製する能力を評価しました。 彼らは、3次元オルガノイドとオルガノイド由来のモノレイヤーを用いてACE2とTMPRSSの発現を調べ、CRISPRベースの遺伝子編集オルガノイドと治療用セリンプロテアーゼ阻害の両方を使用して、TMPRSS2とTMPRSS4の感染への寄与を評価しました。
オルガノイドを使用した腸内感染および免疫の研究
IntestiCult™製品紹介
ヒト腸管オルガノイド用
マウス腸管オルガノイド用
【hPSC由来分化細胞】内皮細胞と心筋細胞を用いたACE2の発現解析
STEMdiff™Endothelial Differentiation Kitを用いた心筋細胞のACE2の発現解析
（A）hPSC（C1細胞株）由来の内皮細胞は、STEMdiff™Endothelial Differentiation Kitを使用して生成され、STEMdiff™Endothelial Expansion Mediumで10,000細胞/ cm2で6継代の間、培養されました。（B）次に、細胞をアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）の発現について分析したところ、細胞の85％が高レベルのACE2を発現しました。
内皮細胞の関連研究
本製品は、最近発売されたため引用文献はございませんが、下記内皮細胞をもちいたCOVID-19関連研究に関する引用文献をご参照ください。
下記文献では、血管オルガノイドへのCOVID-19の感染が rhACE2の添加によって抑制することを報告しております。
COVID-19に感染した患者の組織サンプルにおいて内皮細胞の感染と複数の臓器血管床における損傷を報告しているものもあります。
STEMdiff™ Endothelial 製品紹介
hPSCから内皮細胞への分化培地
hPSC由来の内皮細胞の拡大培養用培地
STEMdiff™ Endothelial Expansion Medium Kit
STEMdiff™ Cardiomyocyte を用いた心筋細胞のACE2の発現解析
15日目と30日目にSTEMdiff™ Cardiomyocyte Differentiation Kitで生成されたhPSC由来心筋細胞からのTNNT2（cTnT）とACE2のバルクRNAseqデータを調べました。これらのhPSC由来心筋細胞は、TNNT2とACE2の両方を発現することがわかっております。心筋細胞のマーカーとして使用されるこのサルコメアタンパク質に期待されるように、TNNT2転写産物の発現レベルはACE2のそれよりもはるかに高いことがわかっております。 ACE2の発現は15日目と30日目に類似しており、これらのhPSC由来の心筋細胞は15日目以降にSARS-CoV-2感染の影響を受けやすいことを示唆しています。これらはSTEMdiff™ Cardiomyocyte Maintenance Mediumを用いて検討されました。（data not shown）
心筋細胞の関連研究
本製品は、最近発売されたため引用文献はございませんが、下記心筋細胞をもちいたCOVID-19関連研究に関する引用文献をご参照ください。
