研究者の声

2020/03/10

全ゲノムの3次元構造をヌクレオソームレベルの高分解能で解析　研究者の声【19】

新規のゲノム構造解析技術でDynabeadsをご利用いただいている理化学研究所　生命機能科学研究センターの大野雅恵先生に感想をいただきました。
ご紹介しておりますHi-CO法は、従来のHi-C法では困難であったヌクレオソームスケールでの構造解析を可能にした画期的な構造解析技術であり、生命現象理解への幅広い応用が期待されています。　

研究者紹介
研究内容
Dynabeadsの活用事例
Dynabeadsを使用しての感想と今後の展望
ご利用いただいた製品
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研究者紹介

理化学研究所　生命機能科学研究センター　細胞システム制御学研究ユニット（谷口ユニット）
研究員　大野雅恵様（写真右）

研究室のウェブサイト(細胞システム制御学研究ユニット・ユニットリーダー谷口雄一)

研究内容

真核生物のゲノムDNAは、まず、ヒストンタンパク質に巻き付いたヌクレオソームと呼ばれる最小基本構造をとり、次に、このヌクレオソームが積み重なった高次構造を形成することで核内に収納されています。
このゲノム構造の形成原理を解明することを目的とし、新規のゲノム構造解析技術の開発を進めています。

最近、私達は、ヌクレオソームの分解能でゲノム構造を決定するHi-CO (Hi-C with nucleosome Orientation, 配向) 法を開発しました。この手法を出芽酵母に適用することで、ヌクレオソームの3次元配置と配向をゲノムワイドで明らかにしました。

発表論文：
Ohno M, Ando T, Priest DG, Kumar V, Yoshida Y, Taniguchi Y, Sub-nucleosomal genome structure reveals distinct nucleosome folding motifs, Cell, 2019, 176(3), 520-534

プレスリリース：
世界最高分解能で全ゲノムの3次元構造を解明－ゲノムの基本構造単位の発見－

Dynabeadsの活用事例

Hi-CO法は、空間的に近い位置にあるヌクレオソームを検出する手法です。ヌクレオソーム（DNA-ヒストンタンパク質複合体）をクロマチン免疫沈降（ChIP）するためDynabeads Protein Gを使用しております。
また、近接関係にあるヌクレオソームのDNA精製のためにDynabeads M-280 Streptavidinも使用しております。

Hi-CO法の操作手順

細胞を化学固定し、DNAとタンパク質をクロスリンク
MNaseを用いてクロマチンをヌクレオソームレベルに切断し、ライセートを調製
78μgの抗ヒストンウサギポリクローナル抗体と1.7mLのDynabeads Protein Gを、5% FA lysis buffer と10% BSA存在下で、4℃で一晩ローテーション
抗体の結合したビーズを5% FA lysis bufferで4回洗浄
2のライセート（ヌクレオソームを含む）と、ヒストン抗体結合ビーズをローテーションさせながら4℃で一晩インキュベート
ChIP後のビーズをEB-T bufferで3回洗浄
DNAリガーゼを用いて、ChIPされたヌクレオソーム内のDNA断片と、ビオチン化アダプターDNAを結合
未反応のアダプターDNAを除去した後、アダプターDNA同士をDNAリガーゼにより結合することで、空間的に近接するヌクレオソーム同士を連結
連結されたアダプターDNAの周辺部のゲノムを切り出し、Dynabeads M-280 Streptavidinを用いて精製
次世代シーケンサーを用いて、DNA配列を解読し、連結されたゲノムの箇所を特定
連結の頻度を距離に変換し、分子動力学シミュレーションを用いて、ヌクレオソームの最適な配置構造を決定

＊実験の詳細につきましては文献中のMethod detailsでご確認ください

Dynabeadsを使用しての感想と今後の展望

【Dynabeadsを使用しての感想】

・操作の簡便性
Hi-CO法は、洗浄の回数が多いため、SepharoseやAgarose beadsと比較して、Dynabeadsだと洗浄の操作が簡便です。

・コスト
Hi-CO法においては、クロマチン免疫沈降したヌクレオソームが多量（DNA量として約1 μg）に必要であるため、1回のアッセイにつき、抗体とビーズをそれぞれ約100 μg、約2 ｍL使用します。コストパフォーマンスの点からDynabeadsを選びました。

【今後の展望】

ゲノムの構造を明らかにすることで、ゲノムを介した様々な生命現象（転写、複製、DNA修復など）の理解につなげたいと考えています。

ご利用いただいた製品

製品コード	製品名	梱包単位
DB10003	Dynabeads Protein G	1 mL
DB10004	Dynabeads Protein G	5 mL
DB10009	Dynabeads Protein G	50 mL
DB10007	Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit	2 mL
DB11205	Dynabeads M-280 Streptavidin	2 mL
DB11206	Dynabeads M-280 Streptavidin	10 mL
DB12321	DynaMag-2	1個
DB12303	DynaMag-5	1個
DB12302	DynaMag-50	1個