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2019/11/12

Dynabeads Protein A / Gを用いた免疫沈降(IP)のコツ、よくある質問とトラブル解決法

  • タンパク・核酸発現解析

免疫沈降(Immunoprecipitation, IP)において気をつけるポイント、よくある質問(FAQ)、そしてトラブルシューティングについてまとめました。
IPワークフローに沿って、各ステップのコツや問題解決法をご紹介します。

免疫沈降で使う一次抗体の選択

一次抗体には、ターゲット(標的タンパク質)への結合特異性があることが前提です。IPでの評価済みの抗体を使用するか、もしくはELISAなどで特異性を予め確認した抗体を使うことをおすすめします。
どうしても抗体価が低い抗体を用いなければならない場合には、抗原と抗体を先に反応させる間接法が適していることがあります。

プロテインAまたはプロテインG(Protein A/G)を介して抗体を担体ビーズに結合させる場合は、動物種とイムノグロブリン(Ig)のクラスによって結合の強弱が異なります(表1)。

表1 Igクラスによるプロテイン A/Gへの結合性の違い

proteina_proteing_affinity.jpg

免疫沈降に用いる担体の選択

セファロース/アガロース(Sepharose/agarose)のスラリーや、磁性ビーズ(Dynabeadsなど)がよく使われます。
セファロース/アガロースはサイズが大きく、サイズがまちまちな多孔質のマテリアルです。表面と内部の両方に抗体が結合するため、タンパク質の大量精製に向いています。
一方で、磁性ビーズであるDynabeadsはサイズが揃った小さい球状で表面のみに抗体が結合し、短時間で効率よく抗原と反応します。そのため純度と再現性が高く、比較的小スケールの免疫沈降に向いています。
特に、セファロース/アガロースによる免疫沈降において、非特異結合のバックグラウンドが高いといったトラブルがある場合は、担体を磁気ビーズに変更するだけで改善が期待できます。

Dynabeadsの洗浄、保存に関するFAQ

免疫沈降における非特異結合、バックグラウンドのトラブルを低減するコツ

免疫沈降において、抗体と標的タンパク質の結合以外の非特異結合を極力少なくすることで、純度が高くバックグラウンドが低い(S/N比が高い)理想の結果を得ることができます。

非特異結合由来のバックグラウンドを減らすにはいくつか方法があります。
まず、Inputサンプルを調製する際の可溶化バッファー(Lysis buffer)に塩や非イオン性界面活性剤を適度に加えることにより、タンパク質間やタンパク質-ビーズ間の非特異結合を減らします。また、ビーズ表面とサンプル、あるいは抗体とサンプルの接触機会を減らすことや、洗浄条件を厳しくすることによって非特異結合によるバックグラウンドを軽減できます。
具体的な対策については以下のFAQをご参照ください。

非特異結合、バックグラウンドに関するFAQ

Protein A/Gに使える担体は? 直接法と間接法って?

免疫沈降をおこなうために一次抗体を担体に結合させる方法としては、プロテインAおよびプロテインG(Protein A/G)を介する反応が最も簡単で一般的です。
他に共有結合させる、二次抗体法、ビオチンーアビジン結合法などがあります。
免疫沈降には直接法(Direct法)、間接法(Indirect法)と云われる2つのアプローチがあります。一般的に、予めビーズ(担体)に結合させておいた一次抗体をターゲット(抗原)と反応させる直接法が用いられますが、一次抗体と抗原を反応させてからビーズに抗原-抗体複合体を結合させる間接法が非特異結合の低減などに有効な場合もあります。

抗体の共溶出を防ぐには・クロスリンク(架橋)

免疫沈降では、一次抗体と担体を共有結合させる場合を除き、標的タンパク質を溶出する際に用いた抗体が共溶出されるトラブルが発生する可能性があります。トラブルを回避するコツとしましては、溶出を低pHなどの穏やかな条件で行うことで、共溶出を減らすことができます。

それでも共溶出が問題になるようなら、予め抗体とビーズを共有結合でクロスリンク(架橋)しておくことが可能です。ただし、クロスリンクによる抗体反応性低下のリスクがあります。

溶出とクロスリンクに関するFAQ

免疫沈降における標的タンパク質の収量に関するトラブル

免疫沈降によって、得られるはずの標的タンパク質が回収できない、あるいは収量が少ないといった場合、いくつかの原因が考えられます。
標的タンパク質の存在量が極めて少ない可能性がありますので、Inputサンプルの量が十分であるかご確認ください。また、タンパク質分解酵素(プロテアーゼ)による分解を防ぐため、Inputサンプルに適切なプロテアーゼ阻害剤を加えてください。
次に、一次抗体の標的タンパク質への結合特異性、およびビーズへの結合特性についてご確認ください。
必要に応じてビーズや抗体の量、インキュベーション時間を調整します。
さらに、直接法と間接法の変更により改善する場合があります。
その他は以下のFAQもご参照ください。

免疫沈降における標的タンパク質解析

免疫沈降後の標的タンパク質を含むサンプルは通常、ゲル電気泳動(SDS-PAGEなど)で分離したあと、ウエスタンブロッティング、質量分析(マススペクトロメトリー、MS)などの方法で検出、同定します。
タンパク質間相互作用や翻訳後修飾など、多くの研究に有用な情報を提供します。

免疫沈降 よくある質問

免疫沈降(IP)

本稿の各項目をご参照ください。その他のFAQは以下リンクからご覧ください。

共免疫沈降(Co-IP)

タンパク質複合体の研究にもちいられるCo-IPについてのFAQです。

クロマチン免疫沈降(ChIP)

タンパク質-DNA結合の研究にもちいられるChIPについてのFAQです。

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