図1. CloneR™3は、hPSCの単一細胞播種後のクローン形成を向上させる
単一細胞播種はクローン樹立のゴールドスタンダードであるが、一般的に効率の低さが課題となる。4種類のヒト多能性幹細胞（hPSC）株（H1、H9、SCTi003-A、WLS-1C）を用い、FACSベースの細胞播種により96ウェルプレートの各ウェルに1細胞ずつ播種した。 CloneR™3を添加したTeSR™-AOF培地で得られたクローンは、Rhoキナーゼ阻害剤（Y-27632）またはCEPTを使用した場合と比較して、クローン形成効率が有意に向上した。4つの細胞株すべてにおいて、CloneR™3の平均クローン形成効率は 29.6 ± 11.8% であった。 一方、Y-27632およびCEPTの平均クローン形成効率はそれぞれ 9.6 ± 8.5%、11.6 ± 8.3% であり、LN-521でプレコートしたプレート上で、各細胞株につき7つの生物学的反復に基づいて評価された。 統計解析として、各細胞株間の比較に対して両側非対応t検定を実施し、*はp < 0.05、**はp < 0.01、***はp < 0.001を示す。

図2. CloneR™3はY-27632と比較してクローン形成効率を向上させる
4種類のヒト多能性幹細胞（hPSC）株（H1、H9、SCTi003-A、WLS-1C）を、クローン密度（50細胞/cm²）でVitronectin XF™上に播種し、Y-27632またはCloneR™3を添加したTeSR™-AOF培地で培養した。 (A) CloneR™3の添加により、Y-27632と比較してhPSCのクローン形成効率が増加することが示された。 (B) 播種後10日目における2種類のhPSC株（H9およびWLS-1C）のウェル全体の代表画像では、CloneR™3添加条件において、1ウェルあたりに観察されるクローン数の増加が確認された。 統計解析として、各細胞株の比較に対して両側非対応t検定を実施し、*はp < 0.05を示す。

図3. CloneR™3は、3D浮遊培養における凍結保存単一細胞の融解後回復を向上させる
凍結保存したhPSCを融解する過程は細胞にとってストレスが大きく、通常は著しい細胞損失や融解後の増殖能低下を引き起こす。単一細胞として凍結保存されたSCTi003-AおよびSCTi004-Aのアグリゲートを、CloneR™3またはY-27632を添加したTeSR™-AOF 3D培地に播種した。 融解後の単一細胞は、非組織培養処理の6ウェルプレートにおいて、オービタルシェーカー上で1 × 10⁵ cells/mLの密度で播種した。 CloneR™3を添加した条件では、Y-27632を添加した条件と比較して、培養4日後の融解後細胞回復率が高いことが示された。2つの細胞株全体で、Y-27632およびCloneR™3における平均細胞収量は、それぞれ 4.1 × 10⁵ ± 10.5%、7.3 × 10⁵ ± 3.6% であった。 各データポイントは、2つのテクニカルリプリケートの平均から算出された1つの生物学的リプリケートを示す。棒グラフは、2つの生物学的リプリケートの平均値 ± 標準偏差（SD）を示す。

図4. CloneR™3は2D培養から3D培養への移行時の細胞収量を向上させる
静置培養である2D培養から3D浮遊培養への移行は、バイオプロセシングにおけるボトルネックの一つであり、hPSCにとってストレスとなり、播種後最初の継代において増殖率の低下を引き起こす可能性がある。 2D培養条件で維持された4種類のhPSC株（H1、SCTi003-A、SCTi004-A、STiPS-M001）を、ReLeSR™を用いて小さな細胞塊に解離し、オービタルシェーカー（軌道径2.5 cm、70 rpm）上で5 × 10⁴ cells/mLの密度で播種した。 4つの細胞株すべてにおいて、CloneR™3を添加したTeSR™-AOF 3D培地に播種したhPSCは、培養4日後において、Y-27632を添加した条件と比較して1.58倍高い細胞収量を示した。 各データポイントは、2つのテクニカルリプリケートの平均から算出された1つの生物学的リプリケートを示す。棒グラフは、3つの生物学的リプリケートの平均値 ± 標準偏差（SD）を示す。 統計解析として、各細胞株の比較に対して両側非対応t検定を実施し、*はp < 0.05を示す。