今回紹介する論文では、低分子を細胞特異的に運ぶための有効な手段である抗体薬物複合体（ADC）として、システイン改変（THIOMAB）抗体と組換えXTENポリペプチドを組み合わせた新しいバイオコンジュゲーション・プラットフォームの開発について述べられています。

従来の低い薬物抗体比（DAR）のADCと比較して、高いDARのTXCは腫瘍や黄色ブドウ球菌に対する抗体媒介送達（AMD）が改善されていることが実証されています。

本研究において、弊社取り扱いのDynabeads^TMは以下のような場面で活用されております。

1. マウスin vivoでの薬物動態評価で、投与した抗体の回収にDynabeads MyOne Streptavidin T1がビオチン化ヒツジ抗ヒトIgG抗体と共に用いられています
2. In vitroでのDARの安定性評価では、ビオチン化したXTEN複合体のアフィニティーキャプチャーにDynabeads M-280 Streptavidinが使用されています。また、この工程では、Thermo KingFisher™ システムで自動処理されています

参照：Chem Sci. 2022 Mar 16; 13(11): 3147–3160.
A homogeneous high-DAR antibody–drug conjugate platform combining THIOMAB antibodies and XTEN polypeptides

Neelie Zacharias, Vladimir N Podust, Kimberly K Kajihara, Douglas Leipold, et al.

本論文では、転写因子TEAD1を介してヒトパピローマウイルス（HPV）の長い制御領域（LCR）に結合する転写補因子を同定するために、子宮頸がん細胞（Ca Ski細胞）の核タンパク質をin vitroでDNAプルダウン精製し、次にプロテオミクス解析がおこなわれました。その結果、子宮頸がん細胞の核に局在し、TEAD1との直接相互作用を介してLCRに結合する炎症性サイトカインS100A9が同定されています。

S100A9を同定するための重要なステップであるDNAプルダウンの工程では、弊社取り扱いのDynabeads M-280 Streptavidinが活用されております。再現性が高く、高品質なDNAプルダウンのための試薬をお探しの方はぜひDynabeadsをお試しください。

参照：Journal of Virology, 2023 Aug; 97(8): e00815-23.
Nuclear proinflammatory cytokine S100A9 enhances expression of human papillomavirus oncogenes via transcription factor TEAD1

Seiichiro Mori, Yoshiyuki Ishii, Takamasa Takeuchi, Iwao Kukimoto

論文では、尿中の膀胱癌および前立腺癌バイオマーカーEN2を迅速かつ高感度に比色検出するためのEN2特異的アプタマーと、高感度かつ特異的な酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ELONA）が報告されております。EN2特異的ssDNAアプタマーをin vitroセレクションする工程では、弊社取り扱いのDynabeads His-tag Isolation & PulldownおよびDynabeads MyOne Streptavidin C1の2製品が活用されております。開発されたアッセイは高い特異性を示し、他のがんマーカーを含む他の尿タンパク質を検出しませんでした。ELONAは、安価で再現性が高く、化学的安定性に優れており、膀胱がんや前立腺がんを早期に発見するための診断ツールとして期待されます。

参照：Scientific Reports volume 12, Article number: 11523 (2022).
Aptamer-antibody hybrid ELONA that uses hybridization chain reaction to detect a urinary biomarker EN2 for bladder and prostate cancer

Eunseon Kim, Minji Kang & Changill Ban

本論文では、IDOがPeroxynitriteによってニトロ化され不活性化されること、IDOタンパク質のTyr15のニトロ化がIDOの不活性化においてもっとも重要な要因であることが示されています。実験では、免疫沈降されたIP-IDOとリコンビナントIDOが使用されており、弊社取り扱いのDynabeads Protein Gと抗ヒトIDO抗体を架橋することでIP-IDOを免疫沈降します。架橋することにより抗体の溶出を防ぎ、ターゲットのタンパク質のみを精製することが可能です。

参照：J Immunol (2006) 176 (1): 372–379.
”Nitration and Inactivation of IDO by Peroxynitrite”

Hidetsugu Fujigaki，et al.

本論文では、内皮細胞（EC）から骨芽細胞（OSB）への移行が正常な骨形成時にも起こるかどうかを検討しており、その結果、OSBの内皮由来に関する新しいパラダイムが示唆されています。マウスCD31陽性細胞の単離ではrat anti-mouse CD31抗体を結合した磁性粒子Dynabeads M-450 Sheep anti-Rat IgG (DB11035)が利用されており、培養アッセイの前処理に有効活用されておりますのでぜひご参考ください。

参照：Volume 26, Issue 2, 17 February 2023, 105994
Endothelial-to-osteoblast transition in normal mouse bone development

Song-Chang Lin，et al.

本論文では、腫瘍細胞に高発現しているNKp44リガンドをターゲットとしたCAR-T細胞の作製と評価をおこなっております。NKp44を用いて作製されたCAR-T細胞は腫瘍細胞に対して特異的な認識と抑制を示しており、将来的なCAR-T細胞療法への応用が期待されております。CAR-T細胞の作製工程におきましては、弊社取り扱いのT細胞活性化用Dynabeads、また末梢血からのT細胞濃縮にはRosetteSepが利用されております。ぜひご覧ください。

参照：Transl Oncol . 2022 Nov;25:101521.
NKp44-based chimeric antigen receptor effectively redirects primary T cells against synovial sarcoma

Yudai Murayama， et al.

クローン病治療における薬効評価として標的タンパク質であるIP-10 (CXCL-10) 抑制の高感度測定が必要とされています。本論文では、フリーおよびトータルIP-10を定量するための高感度イムノアフィニティ LC-MS/MSアッセイを紹介しています。アッセイ感度を最大化するための重要なポイントとして、Dynabeads™磁気ビーズを用いたイムノキャプチャーステップの条件最適化が詳述されております。ぜひご参考ください。

参照：Bioanalysis. 2017 Oct;9(20):1573-1588.
Immunoaffinity LC–MS/MS for quantitative determination of a free and total protein target as a target engagement biomarker

ウイルス研究においてウイルスの濃縮は必要不可欠です。ウイルスの濃縮には通常、超遠心や濾過のような高額な設備が必要になります。「Dynabeads™ Intact Virus Enrichment」は強力に正に帯電する磁気ビーズで、陰イオン交換クロマトグラフィーの原理でHIVのような負電荷をもつウイルス粒子を短時間で濃縮できます。今回紹介するアプリケーションでは、Dynabeadsで濃縮したHIVウイルスの逆転写酵素の活性を、RNAテンプレートに対して合成されたcDNAを定量することで測定しています。

参照：Berit Marie Reed and Ketil W. Pedersen Thermo Fisher Scientific, Inc
Poster: Rapid bead-based enrichment of human immunodeficiency virus (HIV)

ポドサイト（糸球体足細胞）を得る目的などで、腎臓から糸球体分離する方法が試行錯誤されてきました。今回は、マウス心臓を通した灌流によりPBSで希釈したDynabeads™ M-450 Tosylactivatedを糸球体の内部に分布させた後、磁力を用いて傷害なく純度の高い糸球体を分離する例を紹介します。これは従来法であるSieving 法よりはるかに効率が良く、純度は97%を超えています。

原著：American Journal of Pathology 161 (2002) 799–805.
A New Method for Large Scale Isolation of Kidney Glomeruli from Mice

今回紹介する論文では、病原体感染の応答として放出されるシグナルがマクロファージの貪食作用に与える影響を、マウスのⅡ型肺胞上皮細胞と肺胞マクロファージのTranswell®を用いた共培養実験で調べています。 また、同研究ではDynabeadsがマクロファージに取り込まれる（貪食される）性質を利用したファゴサイトーシスアッセイにおいて、リガンド結合処理をしていない素体のDynabeads™ M-450 Epoxyが使われています。

原著：Tissue and Cell 37 (2005) 213–222.
Morphologic changes in alveolar macrophages in response to UVEC-activated pulmonary Type II epithelial cells

ペプチドのシトルリン化はタンパク質中のアルギニン残基が酵素反応で修飾されることで生じます。シトルリン化はアルギニンの正電荷消失によりタンパク質の構造に大きく影響し自己抗原として認識されるため、関節リウマチ（RA）の発症に深く関わると考えられています。
この研究ではRA患者の唾液中のサイトケラチン13（CK13）をDynabeadsで免疫沈降し、溶出したサンプルを抗化学修飾シトルリン化抗体を用いたウエスタンブロッティングでシトルリン化ペプチドを検出しています。

原著：PLoS ONE. 2022 Mar 23; 17(3): e0265687.
Detection of salivary citrullinated cytokeratin 13 in healthy individuals and patients with rheumatoid arthritis by proteomics analysis

自己免疫疾患の研究において、自己の成分に対する自己抗体の反応性を分析することが重要です。 今回紹介する論文では、シェーグレン症候群の病変部位である唾液腺に浸潤したB細胞から作製したリコンビナント自己抗体の反応性を、ストレプトアビジン結合ペプチドタグ（SBP-tag）を付加したリコンビナント自己抗原を結合させたDynabeadsを用いたOn-beads精製、およびFACS解析で調べています。

原著：Ann Rheum Dis. 2020 Jan; 79(1): 150–158.
Antigen-driven selection of antibodies against SSA, SSB and the centromere ‘complex’, including a novel antigen, MIS12 complex, in human salivary glands

研究者の声
自己免疫疾患の研究でDynabeadsを使った免疫沈降が活躍　研究者の声【34】

これまで、診断や予防目的でBordetella pertussis（百日咳菌）などさまざまな細菌表面の膜タンパク質（トランスポーター、トキシン、アドヘシンなど）が特徴付けられてきました。これらのタンパク質サブセットは宿主細胞や病態形成、抗体免疫とも関わることから臨床的にも重要と考えられています。本文献では、Dynabeadsを使用した新規の百日咳菌抗原の同定のための質量分析（nLC-MS/MS: nano-liquid chromatography mass spectrometry）プロトコルを紹介しています。

Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1722.
Surfaceome Analysis Protocol for the Identification of Novel Bordetella pertussis Antigens

生体分子は外部環境の変化や基質の結合をトリガーとした構造変換や自己集合、あるいは他分子との相互作用といった動的現象を介して独自の機能を発現しています。 それらの分子の振る舞いを高精度に計測することで、生体分子がどのように機能しているか、その分子機構の理解につながります。高品質な磁性粒子であるDynabeadsを用いたMagnetic tweezerは力学的操作を加えながら生体分子間の相互作用を計測し、ダイナミクスを把握するのに役立ちます。本論文ではこれを利用してタンパク質の折り畳み/展開のダイナミクスを調べています。

bioRixv January 05, 2021
Magnetic tweezers meets AFM: ultra-stable protein dynamics across the force spectrum

Alonso-Caballero A., Tapia-Rojo R., Badilla C.L., Fernandez J.M.

核酸アプタマー（Nucleic acid aptamers）は抗体に代わる分子認識が可能な物質として、医薬品を含む様々な分野での応用が期待されています。 Dynabeadsは、標的となる抗原タンパク、レクチンなど種々のものをビオチン-アビジン相互作用あるいは化学結合を介してビーズ表面に結合することができ、液相中で標的分子と結合させることができます。反応終了後には、磁石により容易に標的分子複合体を分離できるためSELEX法に最適です。

ラーニングコーナー
核酸アプタマーの探索には「Dynabeads」が最適！

幹細胞様メモリーT細胞（TSCM）は、その名の通りメモリーT細胞の幹細胞であり、長寿命で高い抗腫瘍活性を示すことから、これらの知見は患者への細胞移入後に生じるT細胞疲弊（T cell exhaustion）の防止に役立つ可能性が期待されています。

Cancer Res. 2020 Feb 1;80(3):471-483.
The NOTCH–FOXM1 Axis Plays a Key Role in Mitochondrial Biogenesis in the Induction of Human Stem Cell Memory–like CAR-T Cells

Taisuke Kondo; Makoto Ando; Nao Nagai; Wataru Tomisato; Tanakorn Srirat; Binbin Liu; Setsuko Mise-Omata; Mari Ikeda; Shunsuke Chikuma; Hiroshi Nishimasu; Osamu Nureki; Mitsuyo Ohmura; Noriyo Hayakawa; Takako Hishiki; Ryosuke Uchibori; Keiya Ozawa; Akihiko Yoshimura

研究者の声
CAR-T療法に関わる研究でDynabeadsを使用

Dynabeads T-Activator CD3/CD28 はT細胞刺激試薬のゴールドスタンダードといわれていますが、活性化T細胞へのFoxp3誘導（制御性T細胞の誘導）においても優れた作用を示すことが分かりました。

Sci Immunol. 2019 Oct 25;4(40):eaaw2707.
Conversion of antigen-specific effector/memory T cells into Foxp3-expressing T reg cells by inhibition of CDK8/19

Masahiko Akamatsu, Norihisa Mikami, Naganari Ohkura, Ryoji Kawakami, Yohko Kitagawa, Atsushi Sugimoto, Keiji Hirota, Naoto Nakamura, Satoru Ujihara, Toshio Kurosaki, Hisao, Hamaguchi, Hironori Harada, Guliang Xia, Yoshiaki Morita, Ichiro Aramori, Shuh Narumiya, Shimon Sakaguchi

研究者の声
CDK8/19阻害剤によるFoxp3陽性細胞の誘導でDynabeads使用

「CUT＆Tag」はソニケーション不要でChIP-seqより少ない細胞数で検出できる方法で、Dynabeadsを用いることでアグリゲーションを低減し、様々な細胞で安定して操作が可能になります。Dynabeadsを使えば、安定したCUT & Tag法を再現できます。

PLoS One. 2021 Nov 16;16(11):e0259846. doi:10.1371/journal.pone.0259846. eCollection 2021.
Preparation of optimized concanavalin A-conjugated Dynabeads® magnetic beads for CUT & Tag

Yasuhiro Fujiwara, Yuji Tanno, Hiroki Sugishita, Yusuke Kishi, Yoshinori Makino, Yuki Okada

研究者の声
ChIP-seq法に代わる新しい研究手法CUT & TagでDynabeadsを使用

Dynabeadsを使った共免疫沈降やChIP-seq法により、減数分裂の開始に決定的な役割を担う新規の転写活性化因子MEIOSINの同定に成功しています。

Dev Cell. 2020 Feb 24;52(4):429-445.e10. doi: 10.1016/j.devcel.2020.01.010. Epub 2020 Feb 6.
MEIOSIN Directs the Switch from Mitosis to Meiosis in Mammalian Germ Cells

Kei-Ichiro Ishiguro, Kumi Matsuura, Naoki Tani, Naoki Takeda, Shingo Usuki, Mariko　Yamane, Michihiko Sugimoto, Sayoko Fujimura, Mihoko Hosokawa, Shinichiro Chuma , Minoru S H Ko, Kimi Araki, Hitoshi Niwa

研究者の声
妊娠を左右する遺伝子の発見!! 発見の経緯とDynabeads使用のメリットとは？