ラーニングコーナー
2017/09/20
簡易プロトコール紹介：Dynabeads Protein A / Protein G を用いた免疫沈降（直接法）
Dynabeads Protein™ A / Gは、粒径2.8 µmの均一なビーズ表面に組換え体 Protein A あるいは Protein G を共有結合で固相化した磁性ビーズです。高純度・低バックグラウンドの免疫沈降をわずか40分でおこなえます！
本稿では、直接法による免疫沈降の日本語簡易プロトコールを紹介いたします。
用意する試薬類
バッファー類
- Cell lysis buffer 例）Cell Extraction Buffer、NP40 Cell Lysis Buffer
- PBS, pH7.4 with 0.02% Tween 20
- PBS, pH7.4（Washing Buffer）
- 50 mM Glycine, pH 2.8（Elution Buffer：非変性）
- NuPAGETM LDS Sample Buffer and NuPAGE Sample Reducing Agent （Elution Buffer：変性）
サンプル調製溶液
細胞溶解には、用いるサンプルに適したものを用いてください。
推奨品：
- Cell Extraction Buffer（Thermo Fisher Scientific：#FNN0011）
- NP40 Cell Lysis Buffer（Thermo Fisher Scientific：#FNN0021）
操作方法
Dynabeads Protein A / Gの準備
1. ピペッティングまたはローラーにて回転させ（5 分）、完全にDynabeads Protein A / G（以下、Dynabeads）を再懸濁する
2. チューブへ Dynabeads 50 µL を移し、磁石（DynaMag）に取り付け、上清を除去する
3. 磁石からチューブを外し、抗体結合ステップへ進む
抗体の結合
4. 使用する抗体（通常1 – 10 µL）をTween 20を含むPBS 200 µLで希釈し、3.のチューブへ加える
最適量は使用する各々の抗体に依存します。
5. 室温、回転下で 10 分間インキュベートする
6. チューブを磁石に取り付け、上清を除去する
7. チューブを磁石から外し、Tween 20を含むPBS 200 µLに再懸濁させ、優しくピペッティングすることでDynabeads - 抗体複合体を洗浄する
8. 免疫沈降ステップへ進む
抗原の免疫沈降
9. チューブを磁石に取り付け、上清を除去する
10. Dynabeads - 抗体複合体に抗原を含むサンプル（通常 100 - 1000 μL）を加え、 ピペッティングにより静かに再懸濁する
11. 室温、回転下で10分間インキュベートする
Note：
インキュベーション時間は、標的タンパク質の濃度および抗体の濃度が高い時、短いインキュベーション時間で（10 分）十分にターゲットが捕捉可能です。必要に応じて、インキュベーションは 1 時間まで延長できます。
12. チューブを磁石に取り付け、上清を除去する。必要であれば、上清は新しいチューブへを移しておく
13. 200 μLのPBSで3回Dynabeads - 抗体抗原複合体を洗浄する
14. 100 μLのPBSで Dynabeads - 抗体抗原複合体を再懸濁する
15. 新しいチューブへ Dynabeads - 抗体抗原複合体を含む懸濁液を移す
チューブの壁面についたタンパク質のコンタミを防ぐために移します
16. 「標的抗原の溶出」ステップへ進む
A: 標的抗原の溶出（変性溶出）
17. 磁石にチューブを取り付け、上清を除去する
18. 20 µLのNuPAGE LDS Sample Buffer / NuPAGE Reducing Agent mix（いずれもThermo Fisher Scientific）を加え、優しくピペッティングでDynabeads - 抗体抗原複合体を再懸濁した後、70°Cで 10 分間インキュベートする
Note：
SDSサンプルバッファー等、他のバッファーを用いることも可能です。ゲルにロードする前に、用いるバッファーの推奨する温度、時間でインキュベーションしてください。
19. チューブを磁石に取り付け、上清 / サンプルをゲルにロードする
B: 標的抗原の溶出（非変性溶出）
17. （ステップ16より）磁石にチューブを取り付け、上清を除去する
18. 20 μL の Elution Buffer（50 mM Glycine pH 2.8）を加え、優しくピペッティングでDynabeads - 抗体抗原複合体を再懸濁したDynabeads - 抗原抗体複合体を静かに再懸濁する
この時、泡立たないように注意する
19. 室温で 2 分間インキュベートする
20. チューブを磁石に取り付け、新しいチューブへ目的物を含む上清を移す
もし得られたタンパクを機能的な分析に用いる、あるいは保存する必要がある場合は、溶出液のpHを1 mM Tris-HCl, pH7.5を用いて調整します
ご案内
このプロトコールは、一般的な免疫沈降に対するものです。
各々の抗体とターゲットのために最適化が必要とされるかもしれません。
ここではDynabeads Protein A / Gを50 µLを用いた例を紹介しました。
これは必要に応じてスケールアップあるいはダウンが可能です。
無料サンプルの申し込み
Dynabeads Protein A / Gをフリーサンプルで検討できます。以下のような方におすすめです。
- 免疫沈降は初めて
- バックグラウンドが高い免疫沈降に困っている
- 貴重なサンプルのため極力サンプルロスを減らしたい
- 短時間で免疫沈降をおこないたい
