ラーニングコーナー

2017/09/11

簡易プロトコール紹介:Dynabeads Oligo (dT)25を用いたmRNA抽出・精製

  • タンパク・核酸発現解析

Dynabeads™ Oligo (dT)25は、粒径2.8 µmの磁気ビーズ表面に共有結合したOligo-dTに、mRNA 3'末端のPoly AをハイブリダイズさせてmRNA精製を行います。細胞や組織、全血などの未精製サンプルからダイレクトに純粋なmRNAを15 分で分離でき、少なくとも5,000報以上の論文で引用されています。
本稿では、Dynabeads Oligo (dT)25の日本語簡易プロトコールを紹介いたします。

用意する試薬類

Binding Buffer

20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA

Lysis/Binding Buffer

100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDS, 5 mM dithiothreitol (DTT)
沈殿が観察された場合、室温まで温め、撹拌してすべてのコンポーネントを完全に溶解してください

Washing Buffer A

10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS

Washing Buffer B

10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA 10 mM Tris-HCl, pH 7.5

Reconditioning Solution

0.1 M NaOH

Storage Buffer Oligo (dT)25

250 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM EDTA, 0.1% Tween-20, 0.02% NaN3

 

操作方法

Dynabeadsの準備

  1. ピペッティングまたは、ローラーにて回転させ(5分)、完全に Dynabeads Oligo (dT)25 を再懸濁し、チューブへ200 µL(1mg)を移す
  2. 磁石(DynaMag)に取り付け、上清を除去する
  3. 磁石からチューブを外し、100 µLのBinding Bufferを加え、再懸濁する
  4. 磁石に取り付け、上清を除去する
  5. 磁石からチューブを外し、100 µLのBinding Bufferに再懸濁する

 

細胞溶解液からのmRNAの単離

  1. 100 µLのBinding Bufferに再懸濁した洗浄済みの Dynabeads Oligo (dT)25 を磁石に取り付け、上清を除去し、磁石から外して細胞溶解液を加える
    Note:
    細胞溶解液はDynabeads Oligo (dT)25混合直前に溶解させたものか、使用直前まで-80℃で保存したものを使用してください
  2. Dynabeads Oligo (dT)25と溶解物をよく混合する
  3. ローラー、あるいはミキサーを用いて室温で3 - 5分、アニーリングさせる。
    Note:
    もし、溶液に粘性がある場合にはアニーリング時間を増やしてください。このステップでサンプル中のmRNAはoligo dT配列にアニーリングされます
  4. チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清を除去する
  5. Dynabeads - mRNA複合体にWashing Buffer A(0.5 – 1 mL)を加え洗浄する
  6. チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清を除去する
  7. 続いてWashing Buffer B(0.5 – 1 mL)を加え洗浄する
  8. チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清(Washing Buffer B)を除去する
  9. チューブを磁石から外し、10 – 20 µL 10 mMのTris-HCl, pH7.5に再懸濁させる
  10. 75 – 80℃、2分間インキュベートする
  11. チューブを磁石に取り付け、素早くmRNAを含む上清を新しいRNaseフリーのチューブへ移す

 

Total RNAからmRNAの精製

このプロトコールは75 µgのtotal RNAをスタートサンプルとしています

  1. Total RNAサンプルを75 µL /100 µLになるようにdistilled DEPC-treated waterあるいは10 mM Tris-HCl, pH 7.5を調製する
  2. 100 µLのBinding Bufferを加える。もしTotal RNAの量が75 µL /100 µL未満の場合は、Binding Bufferで最終的に200 µLになるように調整する
  3. RNAの高次構造を解消するために65℃、2分間インキュベートし、直ちに氷冷する
  4. 上記3のチューブに100 µLのBinding Bufferに再懸濁した洗浄済みのDynabeads Oligo (dT)25を加える
  5. ミキサー等で撹拌しながら室温で5分間アニーリングする
  6. チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清を除去する
  7. 200 μLのWashing Buffer B(0.5 – 1 mL)を加え、慎重に2、3回ピペッティングしながら洗浄する。再度チューブを磁石に取り付け、2分間静置後、上清(Washing Buffer B)を完全に除去する
  8. 上記7の洗浄ステップを繰り返す
  9. チューブを磁石から外し、10 – 20 μLの10mM Tris-HCl, pH7.5に再懸濁させる
  10. 75 - 80°C、2分間インキュベートする
  11. チューブを磁石に取り付け、素早くmRNAを含む上清を新しいRNaseフリーのチューブへ移す

 

Dynabeads Oligo (dT)25の再生

同一サンプルを使用する場合

mRNAを溶出した後のDynabeads Oligo (dT)25は同一サンプルであれば再生することなく使用できます。
同じサンプルに対してmRNAを溶出したDynabeads Oligo (dT)25を用いて、同じ操作を繰り返すことでさらにmRNAを単離することも可能です。

異なるサンプルを使用する場合

異なるサンプルを用いる場合には、Dynabeads Oligo (dT)25を再生して使用してください。
5回まで再生して利用することができます。

 

Dynabeads Oligo (dT)25の再生プロトコール

本プロトコールは最初に100 µLのDynabeads Oligo (dT)25を用いた場合です

  1. 使用したDynabeads Oligo (dT)25を最初に分取した際と同量である100 µLのReconditioning Solutionを加え、懸濁液を新しいRNase-free のチューブへ移す
  2. 65°C で2分間インキュベート
  3. 磁石にセットして30秒間静置した後、上清を除去する
  4. Reconditioning Solutionで2回洗浄する(1~3の操作を計3回おこなう)
  5. Dynabeads Oligo (dT)25を100 µLのStorage Bufferに懸濁する
  6. 磁石にセットして30秒間静置した後、上清を除去する
  7. 5 - 6の操作をあと2回(計3回)繰り返す(あるいはpHが8以下になるまでおこなう)
  8. 100 µLのStorage Bufferに懸濁し冷蔵(2-8℃)で保管する
    Note:
    一度用いたDynabeads Oligo (dT)25を保管する場合は、コンタミを防ぐためにオリジナルのバイアルには戻さず、別のチューブで保管してください

 

ご案内

このプロトコールは、一般的なmRNA抽出・精製に対するものです。
ここでは例としてDynabeads Oligo (dT)25を200 µL(1mg)用います(目安:20-50 mg 動物組織サンプル、100 mg 植物組織サンプルまたは1 - 4 x 106 cells)。これは必要に応じてスケールアップあるいはダウンが可能です。
詳細は各製品の添付書またはマニュアルをご参照ください。

 

関連情報

関連製品

記事に関するお問い合わせ