STEMCELL Technologies StemSpan StemSpan Leukemic Cell Culture Kit
- 研究用
StemSpan™ Leukemic Cell Culture Kitは悪性細胞のin vitro培養および増殖用に開発された培地キットで、慢性骨髄性白血病(CML)および急性骨髄性白血病(AML)のサンプルで検証済みです。最適化したプロトコールが用意され、薬物スクリーニングのために悪性細胞を増殖・培養することができます。
本キットには、無血清培地SFEM II(ST-09605)、StemSpan™ CD34+ Expansion Supplement(10X; ST-02691)、および低分子UM729(ST-72332)*が含まれています。
*以前のUM171(ST-72912)から変更されています。
製品の特長
主な特長
- ヒト骨髄性白血病細胞の培養、増殖、および薬物スクリーニングに最適化
- CD34+CML細胞あたり、CD34+細胞を約65倍まで増殖
- CD34+AML細胞あたり、CD34+細胞を約30倍まで増殖
- 無血清
データ例
以下の実験は凍結保存した細胞を用いましたが、新鮮なサンプルでも同様の結果が予想されます。
また、低分子としてUM729の代わりにUM171を用いていますが、UM729(終濃度1 uM)でも同等の結果が期待されます。ただし、特定の条件で細胞増殖を最適化するには、さらに滴定が必要になる場合があります。UM171とUM729の比較データを含む詳細は、Fares et al. 2014をご参照ください。
図1. 白血病ドナー由来CD34+細胞の分離
凍結保存したCMLまたはAMLのPBMCおよびBMMCを解凍し、分離の準備をしました。EasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit IIでCD34+細胞を分離しました。分離前(A, C)と後(B, D)のCD34+細胞の割合をフローサイトメトリーで測定しました。死細胞は光散乱プロファイルおよび生細胞染色で除外しました。この例では、CD34+細胞の純度は3%から82%(CML)および16%から93%(AML)にそれぞれ増加しました。
図2. CD34+CML細胞の増殖
CD34+ CML細胞をUM171の有無にかかわらず、CD34+ Expansion Supplement(Exp)を含むStemSpan™ SFEM IIで培養しました。培養7日後と14日後、培養細胞をCD45、CD34、CD90、CD45RAに対する蛍光標識抗体で染色し、ALDH活性測定のためのALDEFLUOR™試薬(ST-01700)で染色し、フローサイトメトリーで分析しました。シーケンシャルゲートを使用して、CD45+、CD45+CD34+、CD45+CD34+CD90+CD45RA-生存細胞(「Fluorescence Minus One」(FMO)コントロールに基づく)、およびALDHbr細胞(DEABコントロールに基づく)の割合を決定しました。
(A)培養7日目の典型的なフローサイトメトリーのプロファイルです。(B, C)培養7日目と(D, E)14日目のサブセットの(B, D)頻度と(C, E)最初のCD34+細胞あたりの細胞数です。CD34+ Expansion Supplementを添加したStemSpan™ SFEM IIは、培養中のCML細胞の増殖をサポートします。UM171の追加により、調べたすべてのサブセットの増殖が促進されました(UM171を含まない培養と比較して、培養7日目でCD34+ 前駆細胞が10倍、14日目で20倍に拡大)。
データは平均値±SEM(n = 6)で表示。P値はtwo-tailed paired Student’s t-testで計算(* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.0001)。
調べた6つのCMLサンプルはすべて培養・増殖できました。
図3. CD34+AML細胞の増殖
CD34+ AML細胞をCD34+ Expansion Supplement (Exp) 単独またはUM171を含むStemSpan™ SFEM IIで培養しました。培養7日後と14日後、培養細胞を蛍光標識抗体とALDEFLUOR™(ST-01700)で染色しました。(A)7日目の代表的なフローサイトメトリープロファイル。(B, C)7日目および(D, E)14日目のサブセットの(B, D)頻度、および(C, E)最初のCD34+細胞あたりの細胞数。CD34+ Expansion Supplementを添加したSFEM IIは、培養中のAML細胞の増殖をサポートします。UM171を追加すると、調べたすべてのサブセットの増殖を促進します(UM171を含まない培養と比較して、培養7日目にすべてのサブセットが3倍、14日目に7倍に拡大)。データは平均値±SEM(n = 6)で表示。P値は、two-tailed paired Student’s t-testで計算(* P <0.05; ** P <0.01)。 調べた10個のAMLサンプルのうち6個が培養・増殖できました。
図4. CD34+ CML細胞のコロニー形成能は培養中も維持
CML細胞はCD34+細胞を分離直後(培養0日目)、およびUM171の有無にかかわらずCD34+ Expansion Supplement (Exp) を含むStemSpan™ SFEM IIで7日間または14日間増殖させた後(図2参照)、MethoCult™ H4435 Enriched培地に播種してコロニーアッセイを行いました。コロニーを(A)STEMvision™でデジタル画像化し、手動でカウントした。(B)最初のCD34+細胞あたりのコロニー総数として表されるCFUアウトプットです。各バーの上にある数字は6つの異なるサンプル(個々の条件ごとに8〜12個のコロニーを採取)のqRT-PCRで測定したBCR-ABL陽性コロニーの割合を示します。CD34+ Expansion Supplementを追加したSFEM IIは、培養中のコロニー形成前駆細胞の増殖をサポートします。UM171はコロニー形成前駆細胞のアウトプットをさらに促進します(7日目で約3.5倍、14日目で約8倍)。シングルコロニーqRT-PCR分析により、0日目サンプルから形成したコロニーと、7日間および14日間増殖させた細胞から形成したコロニーは主にBCR-ABL+でしたが、正常なBCR-ABL-前駆細胞もわずかに存在しました。データは平均値±SEM(n = 6)で表示。P値はtwo-tailed paired Student’s t-testで計算(* P <0.05)。
図5. CD34+ AML細胞のコロニー形成能は培養中も維持
AML細胞はCD34+細胞を分離後(培養0日目)、およびUM171の有無にかかわらずCD34+ Expansion Supplement (Exp) を含むStemSpan™ SFEM II で7日間または14日間増殖させた後(図3参照)、MethoCult™ H4435 Enriched培地に播種してコロニーアッセイを行いました。コロニーを(A)STEMvision™でデジタル画像化し、手動でカウントしました。(B)最初のCD34+細胞あたりのコロニー総数として表されるCFUアウトプット。CD34+ Expansion Supplementを追加したSFEM IIは、培養中のコロニー形成前駆細胞の増殖をサポートします。UM171はコロニー形成前駆細胞のアウトプットをさらに促進すします(培養7日目で約3倍、14日目で約4倍)。データは平均値±SEM(n = 6)で表示。P値はtwo-tailed paired Student’s t-testで計算(* P <0.05)。