背景

白血病は、造血幹細胞・前駆細胞(hematopoietic stem and progenitor cell: HSPC)の悪性形質転換、クローン増殖を特徴とする血液や骨髄の疾患群です。
本技術報告では、慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia: CML)または急性骨髄性白血病(acute myeloid leukemia: AML)の患者から分離したHSPCを血清を含まないStemSpan™培地やサプリメントを使用して培養する方法について記述しています。以下で述べるプロトコールは通常のHPSCを分離・培養する方法から独自に開発されたものであり、CML,AMLの幹細胞・前駆細胞から分離されたCD34陽性細胞のin vitroでの効率的な増殖を可能とします。スタートサンプルの細胞数が少ない場合や、細胞の品質が良好でない場合にもご利用頂けます。 CMLは9番染色体と22番染色体間で相互転座が起こってフィラデルフィア(Ph)染色体ができることが原因で起こります (Figure 1)。
融合遺伝子は恒常的な活性化チロシンキナーゼであるBCR-ABLがんタンパク質をコードしており、RAS/MAPK、 PI3K/AKT、JAK2/ STAT5など多くのシグナリング経路を撹乱することにより発病を引き起こします。これらのシグナリング経路の制御が乱れることにより、細胞増殖の亢進・アポトーシス減少が起こり、結果として循環血液中に骨髄細胞（大部分は顆粒球）の集積が起こります。
この単一の特異的な遺伝子変異が同定されたことにより、CMLは他のタイプのがんにも通用するモデル疾患となり、これによりがんの進化研究やがん化した細胞を標的とした分子治療法の開発が可能となりました。BCR-ABLがんタンパク質をターゲットとした白血病細胞の生存と増殖を抑制するイマニチブやダサチニブなど、特定のチロシンキナーゼ阻害剤を治療に導入したことにより、近年CML患者の生存率と予後は改善されました。

Figure 1. BCR-ABL融合遺伝子
BCR-ABLタンパク質をコードするフィラデルフィア(Ph)染色体の生成と生物学的影響についての略図。
Lydon, 20096より改作

Table 1. AMLで確認される遺伝子異常

AMLはCMLよりもはるかにヘテロな疾患であり、染色体や遺伝子異常のタイプは様々であり、それらのリスクプロファイルや生存率、再発率も異なります (Table 1)¹。 さらに、AML患者の細胞にはしばしば複数の遺伝子異常がある場合があり、それらの遺伝子異常は疾患の発病や進行に独特な影響を及ぼします。 CMLとAMLの研究は両者とも、通常のHSPCに用いられてきたものに類似したin vitroの細胞培養システムを利用することによって飛躍的に発展してきました。In vitro培養系はこれらの疾患の基礎生物学的な部分を解明するために使用されてきましたが、患者のプライマリー細胞を用いればチロシンキナーゼインヒビターなどの化合物やその他の治療法候補をスクリーニングするためにも利用することができます²⁻⁴。しかしながら、プライマリーの白血病HPSCについての研究は、患者のサンプルの回収量が少ない、解凍後の凍結保存細胞の生存率が低いなどの原因からしばしばその利用に制限が出てしまうものとなっています。
貴重な患者サンプルを培養する際には、信頼性が高く、成分の把握できており、お使いの細胞種に最適な培地を選択することが重要です。本技術報告では、細胞培養に必要なStemSpan™ Serum-Free Expansion Medium II、StemSpan™ CD34+ Expansion Supplement、UM729 が付属したStemSpan™ Leukemic Cell Culture Kit を使用した実験系についてご紹介しています。⁵
StemSpan™ SFEM、 StemSpan™ CC100や StemSpan™ CC110 などその他の培地やサプリメント、また小分子などは類似した培養条件を作り出すために利用されることがあります。本技術報告の実験では小分子のUM171を使用していますが、終濃度1μMでUM729を使用した際にも類似した結果が期待できます。

Figure 2.白血病CD34陽性細胞の一般的な細胞培養プロトコール
CMLまたはAMLのサンプルからEasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit IIを使ってCD34陽性細胞を純化し、UM729の存在下または非存在下にてStemSpan™ CD34+ Expansion Supplement を添加したStemSpan™ SFEM II中で14日間培養します。細胞は培養0、7、14日後にMethoCult™ H4435 Enriched mediumを使用したコロニー形成ユニット(CFU) アッセイや一般にHSPCの細胞表面に発現するマーカー分子についてのイムノフェノタイピングをおこない解析します。
*本技術報告で記載されている実験は凍結保存細胞を用いておこなわれておりますが、新鮮サンプルでも同様の結果が期待できます。また、Figure 4から7では、UM729の代わりにUM171が使用されています。現在UM171はSTEMCELL Technologiesではライセンスされていませんが、代わりにUM729を終濃度1 μM でご使用頂くことで同様の結果が期待できます（データ非開示）。特定の条件で細胞増殖を最大化したい場合には、さらに濃度の検討が必要となります。UM171とUM729の比較データを含めたさらなる詳細については、文献（Fares et al. 2014）をご参照ください。

白血病細胞培養が利用されるアプリケーション

• CMLやAMLの新しい治療法開発研究
• 疾患の進行と白血病幹細胞・前駆細胞のクローン進化に関する研究
• 現在の治療法に対する白血病幹細胞・前駆細胞の抵抗性、再発のメカニズムの解明
• 新規治療法に対する患者の反応を予測するアッセイ系の開発やバイオマーカーの同定

プロトコール

　 分離

1. 新鮮な末梢血単核球(PBMC)または骨髄単核球(BMMC)を使用する場合にはステップ2からおこなってください。
   
   凍結PBMCまたはBMMCを使用する場合には、サンプルの入った1 mLバイアルを37℃のウォーターバスで解凍してください。解凍後はすぐに、0.5 mLのDNase I Solutionを添加して穏やかに混合し、室温(15 - 25°C)で5分間インキュベートします。CD34陽性細胞の分離前は細胞回収量と生存率が低下する恐れがあるため、サンプルの洗浄はお勧め致しておりません。この方法で細胞を解凍して頂くことにより、白血病CD34陽性細胞の回収量を増やし、生存率を向上させることができます。
2. EasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit IIを使用し、（DNase I処理した解凍PBMC/BMMC、またはステップ1から処理した新鮮PBMCから）CD34陽性細胞を分離します。このキットは元来臍帯血(CB)に使用するために設計されたものですが、CMLやAMLサンプルにも使用可能であることが広く確認されています。
3. トリパンブルーと血球計算盤、または自動セルカウンターを使用して生細胞の細胞数とパーセンテージを求めます。十分な細胞数が得られている場合には、CD34陽性細胞のパーセンテージはフローサイトメトリーにより測定することも可能です。サンプル中のCD34陽性細胞の細胞数や濃度は、生細胞のトータル細胞数にCD34陽性細胞のパーセンテージをかけることにより算出することができます。

   培養

   
   
   
4. 次の試薬を混合し、100 mLの白血病細胞培養用培地を調整します：
   • 90 mL StemSpan™ SFEM II
   • 10 mL StemSpan™ CD34+ Expansion Supplement
   • UM729 （終濃度1μM*）
5. 5. CD34陽性細胞（生細胞）を次のいずれかの要領で播種します：
   • 96 wellプレート1ウェルあたり、細胞1000個を100μLの白血病細胞培養用培地に懸濁して播種
   または、
   • 12 wellプレート1ウェルあたり、細胞1000-10000個を1 mLの白血病細胞培養用培地に懸濁して播種
6. 7日間 37°C でインキュベートします。**
7. Day 7になったら細胞を回収して洗浄し、1 mLのIscove’s MDM （サイトカイン、サプリメント添加なし）に懸濁します。
8. 細胞懸濁液の10%分を、新鮮なleukemic cell culture medium (ステップ 4で調整したもの)に懸濁して再度播種し、37℃でさらに7日間インキュベートします。
9. Day 14になったら細胞を回収して洗浄し、ステップ7と同様に再懸濁します。
   

   *UM171を使用する場合には、終濃度 が175 nMとなるように調整してください。
   **細胞培養期間の長さは、実験の目的や必要性に応じて調整いただけます。7日間以上培養する場合は、Day 7にステップ7と8をおこなっていただき、その後も7日ごとに同様の操作をおこなって頂くことをお勧め致します。

   解析

   
   
   
10. a.フローサイトメトリー解析により、Day 0、培養後のDay 7とDay 14においてHSPCマーカー分子（CD45, CD34, CD45RA, CD90）を発現する細胞の細胞数と発現型を決定します（CD34陽性細胞分離の後、解析に必要な数の細胞が得られた場合）。
    初期の幹細胞、前駆細胞で高いアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)活性についても、ALDEFLUOR™を使用してHSPCマーカー染色と一緒におこなって頂くことが可能です。
    b. MethoCult™ H4435 Enriched mediumを使用したコロニーアッセイにより、Day 0、培養後のDay 7, Day 14の造血前駆細胞の発生頻度と細胞数を計測します（プロトコールと播種密度については、StemSpan™ Leukemic Cell Culture Kitの製品情報シート(PIS)( Document #DX23137)をご参照ください）。
    培養14日後にコロニー数をカウントしてください。

オプション： CMLサンプル由来のコロニーはDay 14に回収し、BCR-ABLのステータスを同定するためのcDNA調整・ qPCRなど、さらなる解析にご使用可能です。プライマーについての情報はTable 2をご参照ください。 AMLサンプルの場合にはシーケンシングやqPCRにより、融合遺伝子やその他の遺伝子変異の有無を確認することができます。

Figure 3. 白血病CD34陽性細胞の分離
凍結保存されたCMLやAMLのPBMC、BMMCは解凍し、プロトコールのステップ1に記載された方法に従って処理しました。CD34陽性細胞はEasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit IIを 用いて分離しました。CD34陽性細胞のパーセンテージはCD34陽性細胞の細胞分離前(A, C)と後(B, D)についてフローサイトメトリーで測定しました。死細胞は光散乱プロファイルと生死判定細胞染色によって排除しました。この例ではCD34陽性細胞の純度がCMLで3%から82%、AMLで16%から93%に増加しました。

Figure 4. CD34陽性CML細胞の増殖
CD34陽性CML細胞の培養については3ページ目のプロトコールに従い、CD34⁺ Expansion Supplement (Exp)を添加したStemSpan™ SFEM II を使用してUM171(UM)の存在下、または非存在下で培養をおこないます。細胞は培養7日後と14日後にCD45、CD34、CD90、CD45RAの各蛍光標識抗体、また、ALDH活性を測定するALDEFLUOR™で染色し、フローサイトメトリーで解析しました。一連のゲートは生きたCD45+、CD45+CD34+、CD45+CD34+、CD45+CD34+CD90+CD45RA-細胞（各細胞集団のゲートはFluorescence Minus One (FMO)コントロールとの比較により決定）とALDHbr細胞（DEABコントロールとの比較により決定）のパーセンテージを求めるために設定しました。(A)Day 7における代表的なフローサイトメトリープロファイル。インプットしたCD34陽性細胞1個から発生する各ゲートの細胞サブセットの発生頻度(B, D)とそれらの細胞数(C, E)。(B、C)はDay 7、(D、E)はDay 14に得られたデータです。
CD34⁺ Expansion Supplement (Exp)を添加したStemSpan™ SFEM IIは細胞培養においてCMLの細胞増殖をサポートします。UM171の添加により、全てのサブセットの増殖が亢進します。（CD34陽性の前駆細胞はUM171無しの場合と比較して、Day 7で〜10倍、Day 14で〜20倍に増加しました。）UM729を終濃度1μMで使用した場合にも同様の結果が期待できます。データは平均値± SEMの形で示しました(n=6)。P値は両側検定のStudentのt検定を用いて算出しました（*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.0001)。6つのCMLサンプルは全て細胞培養において増殖可能でした。

Figure 5. CD34陽性AML細胞の増殖
プロトコールの記載に従い、CD34陽性AML細胞はCD34⁺ Expansion Supplement (Exp)のみを添加したStemSpan™ SFEM II、またはこれにさらにUM171(UM)を添加した培地を用いて細胞培養しました。培養7日後と14日後、Figure 4と同様に細胞を蛍光標識抗体とALDEFLUOR™で染色しました。(A) Day 7における代表的なフローサイトメトリープロファイル。CD34陽性細胞一個から発生する各ゲートの細胞サブセットの発生頻度(B, D)と細胞数(C, E)。(B、C)はDay 7、(D、E)はDay 14に得られたデータです。CD34⁺ Expansion Supplement (Exp)を添加したStemSpan™ SFEM IIは細胞培養においてAMLの細胞増殖をサポートします。UM171の添加により、全てのサブセットの増殖が亢進します。（CD34陽性の前駆細胞はUM171無しの場合と比較して、Day 7で〜3倍、Day 14で〜7倍に増加しました。）UM729を終濃度1μMで使用した場合にも同様の結果が期待できます。データは平均値± SEMの形で示しました(n=6)。P値は両側検定のStudentのt検定を用いて算出しました（*P < 0.05; **P < 0.01）。10個のAMLサンプルのうち、6個が細胞培養で増殖可能でした。

UM171の存在下で培養した場合には、AML培養におけるDay 7とDay 14でのCD34+細胞、
CD34+CD90+CD45RA-細胞、ALDHbrの細胞の発生頻度(Figure 5)はCMLサンプルの場合(Figure 4)と類似していました(CML、AMLサンプルともDay 7でCD34陽性細胞が〜80%)。一方、CD34+細胞、CD34+CD90+CD45RA-細胞、ALDHbrの細胞の細胞数はそれぞれ、AMLサンプルの場合(Figure 5)はCMLサンプルの場合（Figure 4）よりも2.5倍少なくなっていました（Day 7でのCD34陽性細胞の増殖はCMLサンプルで〜70倍であるのに対してAMLでは〜30倍）。

Figure 6. 培養中のCD34陽性CML細胞ではコロニー形成能が維持されています
CML細胞のコロニーアッセイは、CD34陽性細胞分離直後(Day 0)、UM171(UM)の存在下または非存在下での細胞増殖後7日、14日の細胞(Figure 4参照)に対して、MethoCult™ H4435 Enriched medium を使用しておこないました。コロニーは、CD34⁺ Expansion Supplement (Exp)を添加したStemSpan™ SFEM II を使用してUM171の存在下、または非存在下で14日間培養し、次のデータを得ました。(A)STEMvision™で取得したコロニー画像。コロニー数はこのデジタル画像を基に手動でカウントしました。(B) インプットしたCD34陽性細胞1個から発生するコロニーの総数として表されるCFUアウトプット。各の棒グラフの上にある数値はBCR-ABL陽性コロニーの前コロニーに対する存在比率であり、6つの異なるサンプルから個別に採取したコロニーについてqRT-PCRをおこなった結果に基づいています（各実験条件のサンプルあたり8-12個のコロニーを採取して使用。プライマーと作業工程の詳細についてはTable 2、Figure 8を参照ください）。CD34⁺ Expansion Supplement (Exp)を添加したStemSpan™ SFEM IIは、コロニー形成中の前駆細胞の増殖をサポートします。UM171により、そのコロニー形成能はさらに亢進します（Day 7で〜3.5倍、Day 14で〜8倍の増殖）。UM729を終濃度1 μMで使用した場合にも、同様の結果が期待できます。コロニー1個に対してqRT-PCRをおこなう事により、Day 0、増殖後のDay 7、Day 14のサンプルから得られたコロニーでは大部分がBCR-ABL陽性でありながら、BCR-ABL陰性の正常な前駆細胞も低頻度で存在することが明らかになりました。データは平均値± SEMの形で示しました(n=6)。P値は両側検定のStudentのt検定を用いて算出しました（*P < 0.05）。

Figure 7. 培養中のCD34陽性AML細胞ではコロニー形成能が維持されています
AML細胞は、CD34陽性細胞分離直後(Day 0)、UM171の存在下または非存在下での細胞増殖後7日、14日の細胞（Figure 5参照）を使用し、MethoCult™ H4435 Enriched mediumを利用したコロニーアッセイをおこないました。インキュベーション14日後に次のデータを得ました。
(A)STEMvision™で取得したコロニー画像。コロニー数はこのデジタル画像を基に手動でカウントしました。 (B) インプットしたCD34陽性細胞1個から発生するコロニーの総数として表されるCFUアウトプット。CD34⁺ Expansion Supplement (Exp)を添加したStemSpan™ SFEM IIは、コロニー形成中の前駆細胞の増殖をサポートします。UM171を添加する事により、そのコロニー形成能はさらに亢進します（Day 7で〜3倍、Day 14で〜4倍の増殖）。UM729を終濃度1 μMで使用した場合にも、同様の結果が期待できます。データは平均値± SEMの形で示しました(n=6)。P値は両側検定のStudentのt検定を用いて算出しました（*P < 0.05）。

Table 2. 使用されたプライマーとプローブの配列と終濃度、プライマー効率

Figure 8.プローブを使用したqPCRアッセイにより、CMLサンプルから分離されたCD34陽性細胞のCFUアッセイで生じた1個のBCR-ABL陽性コロニーを検出することができます。
Figure 6で示したように、プローブを使用したqPCRアッセイは細胞を増殖させる前、7日間増殖、14日間増殖それぞれの時点のCML細胞から得られた1個のBCR-ABL陽性コロニーを同定する目的で使用することが可能です。プライマーセットは全て90%を超えるプライマー効率であり、たった10個のDNAコピーを検出することができます。b2a2合成DNAフラグメントに対してBCR-ABLの汎用プライマーを用いた場合の増幅曲線 (Amplification plot)と標準曲線。 各曲線グラフ横の数字はDNAコピー数を表しています。プライマーとプローブの配列、終濃度、プライマー効率はTable 2に示しました。

References

1. Döhner H et al. (2015) N Engl J Med 373(12): 1136–52.
2. Pabst C et al. (2014) Nat Methods 11(4): 436–42.
3. Liao Z et al. (2015) Mol Cancer Ther 14(8): 1777–93.
4. Baccelli I et al. (2017) Blood Cancer J 7(2): e529.
5. Fares I et al. (2014) Science 345(6203): 1509–12.
6. Lydon N. (2009) Nat Med 15(10): 1153–7.

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