なぜ薬剤スクリーニングにStemSpan^TMを使用するのか？

使いやすい

　培養条件によりCD34陽性白血病細胞の増殖と維持の両方が可能

複数の検出器が使用可

　フローサイトメトリーやプレートリーダーなど様々な方法により、細胞増殖の変化を評価することが可能

迅速な試験系

　CFUアッセイよりもシンプルな手法、より迅速に結果を取得（７日程度）

検証済みのIC50

　CFUアッセイと類似した半数阻害濃度(IC50)値^＊が得られる
　　^＊IC50はin vitroのアッセイで血液毒性を測定する際の基準となっています。

In Vitro薬剤スクリーニングアッセイ法

96 wellプレートを使用する薬剤スクリーニングアッセイでは、定量的な比較が可能で、迅速に結果を得ることが可能です。
さらに、この液体培養ベースのアッセイから得られる結果は、細胞系列特異的なHemaTox™アッセイ(ST-09704)と同様に、CFUアッセイから得られる結果に相関します³。
CFUアッセイは薬剤の有効性や細胞毒性を測定するために使用されておりますが、StemSpan™ Leukemic Cell Culture Kit では、アッセイがより迅速に、なおかつ、フローサイトメトリーやプレートリーダーでの検出が可能となっております。

CD34陽性のCMLまたはAML細胞は、非増殖細胞・増殖細胞の両方を、白血病細胞の細胞増殖における試験化合物の影響を評価するための薬剤スクリーニングに使用します。
薬剤スクリーニングアッセイの解析方法には、自動セルカウント、プレートリーダーベースのセルカウント、またはフローサイトメーターによるラベルされた細胞(例：7-AAD陰性細胞、CD45陽性細胞、または CD34陽性細胞など)の絶対細胞数のカウントなどが含まれます。

Figure 1. 一般的な細胞毒性分析の手順

EasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II (ST-17896)を使って、CMLまたはAMLの患者由来の末梢血単核細胞(PBMC)または骨髄単核細胞(BMMC)からCD34陽性細胞を単離します。その後 StemSpan™ Leukemic Cell Culture Kitを使って細胞を7〜14日間増殖させます。非増殖細胞、増殖細胞をその後96 wellプレート、StemSpan™ Leukemic Cell Culture Medium中で37℃、７日間培養し、フローサイトメトリーやその他の解析を行いIC50値を決定します。

1. 製品情報資料の記載に従ってStemSpan™ Leukemic Cell Culture Mediumを調整します。
2. 適当な溶媒を用いて、試験化合物が培養時検査の際に1000倍希釈以上となるように希釈します。これが試験化合物の保存溶液(test compound stock solution)となります。
3. ステップ２で調整したtest compound stock solutionをStemSpan™Leukemic Cell Culture Mediumで二倍希釈をして2X test compound solutionを調整します。
4. 溶媒コントロールを作製するために、コントロール溶媒(control solvent)をStemSpan™ Leukemic Cell Culture Mediumに添加して2X test compound solution中の試験化合物と同じ濃度になるように調整します。
5. 製品情報資料の記載に従って、CD34陽性のCMLおよびAML細胞(非増殖細胞、増殖細胞)を調整します。
6. プレーティング直前に、細胞濃度が1000 - 8000 viable CD34+ CMLまたはAML cells/100 μL (10,000 - 80,000 cells/mL)となるようにStemSpan™ Leukemic Cell Culture Mediumで希釈します。
7. ステップ6で調整した細胞懸濁液100 μLを、flat-bottomの96 wellプレートの各ウェルに添加します。
8. 2X test compound solution また は溶媒コントロール100 μLを各ウェルに添加し、穏やかにピペッティングして混合します。
9. スクエア皿(例：ST-27140など)に96 wellプレートを置き、その周囲に滅菌水を満たした4 x 35 mm ディッシュ(例：ST-27100など)を置いて囲みます。
10. 37℃、5% CO2 、湿度> 95%で７日間インキュベートします。
11. フローサイトメトリーを使用して表現型タイピングを行うため、細胞を複数の表面マーカー(例：HSPCのマーカーとしてのCD34やCD45)でラベルします。染色はALDEFLUOR™アッセイと並行して行われることもあります。細胞標識の詳細についてはこちらをご参照ください。
12. フローサイトメトリーなどで解析します。

解析結果例

CD34陽性のCMLまたはAML細胞の増殖に対する試験化合物の効果を測定するために、ユーザーは複数の読み出し方法を選ぶことができます。
推奨される方法としては、培養細胞を細胞系列特異的な細胞表面マーカーに対して染色し、それらのマーカー分子を発現する細胞の絶対数をカウントすることができるフローサイトメーターを使用した手法などがあります。
これによりアッセイにおける各試験化合物の反応を定量化し、50%、90%の抑制濃度（各IC50 と IC90）を見積もることが可能となります。
他の手法 (自動セルカウント、イメージングサイトメトリー、プレートリーダーベースの方法など)も使用可能ですが、条件の最適化が必要になる場合があります。

Figure 2. CML細胞にStemSpan™ Leukemic Cell Culture Mediumを使用した薬剤スクリーニングアッセイ

CD34陽性のCML細胞をStemSpan™ Leukemic Cell Culture Medium中でイマチニブ(Imatinib (IM))とダサチニブ(dasatinib (DA))により７日間処理しました。細胞は増殖をモニタリングするために、2日に１回高解像度のイメージングシステムによってイメージ取得し、フローサイトメトリーでIC50を測定するため７日後に回収しました。(A) IMおよびDA処理後７日目における代表的な細胞画像(非増殖細胞)。IMおよびDA処理は低〜中濃度で行い、サンプルはn=3で行った結果を示しています。緑でハイライトされた細胞群（低密度）と赤でハイライトされた細胞群（高密度）が見られます。 (B) IMおよびDA処理した場合の代表的な成長曲線（非増殖細胞）。成長曲線はイメージングシステムを使って2日に１回撮像された細胞画像と、その細胞密度アルゴリズムを使って得られました。(C) 非増殖細胞、増殖細胞(７日間培養)、増殖細胞(14日間培養))の用量応答曲線。曲線は薬剤処理７日後にフローサイトメトリー解析で7-AAD陰性であった細胞を対象として作製しました。各薬剤濃度における細胞数は、溶媒コントロールの細胞数を基準として標準化しました。（Ctrlに対する%として）

Figure 3. AML細胞にStemSpan™ Leukemic Cell Culture Mediumを使用した薬剤スクリーニングアッセイ

CD34陽性のAML細胞をStemSpan™ Leukemic Cell Culture Medium中でドクソルビチン(doxorubicin (DOX))とアザシチジン(azacitidine (AZA))により７日間処理しました。細胞は増殖をモニタリングするために、2日に１回高解像度のイメージングシステムによってイメージ取得し、フローサイトメトリーでIC50を測定するため７日後に回収しました。(A) DOXおよびAZA処理後７日における代表的な細胞画像(増殖細胞(7日間培養))。IMおよびDA処理は低〜中濃度で行い、サンプルはn=2で行った結果を示しています。緑でハイライトされた細胞群（低密度）と赤でハイライトされた細胞群（高密度）が見られます。(B) DOXおよびAZA処理した場合の代表的な成長曲線（増殖細胞(7日間培養))。成長曲線はイメージングシステムを使って2日に１回撮像された細胞画像と、その細胞密度アルゴリズムを使って得られました。(C)増殖細胞(７日間培養)、増殖細胞(14日間培養))の用量応答曲線。曲線は薬剤処理７日後にフローサイトメトリー解析で7-AAD陰性であった細胞を対象として作製しました。

Figure 4. CFUアッセイを用いて得られたIC50値と96 wellプレートでの液体培養ベースの細胞毒性分析との相関性

CML、AML、CBにおけるCD34陽性の非増殖および増殖細胞について、MethoCult™ H4435 Enriched mediumを用いたCFUアッセイ培養と、以下の4つの薬剤の存在下でのStemSpan™ Leukemic Cell Culture Mediumを用いた液体培養を行ないました：DOX (緑), AZA (青), IM (赤), DA (黒)。AML細胞にはDOXおよびAZA処理、CML細胞にはIMおよびDA処理を行ないました。CB細胞にはDOX、AZA、IM、DA処理を行ないました。

参考文献

1. Lai D et al. (2018) PP2A inhibition sensitizes cancer stem cells to ABL tyrosine kinase inhibitors in BCR-ABL+ human leukemia. Science Translational Medicine 10(427).
2. Minzel W et al. (2018) Small molecules co-targeting CKIα and the　transcriptional kinases CDK7/9 control AML in preclinical models. Cell 175(1): 171-185.
3. Uppal H et al. (2015) Potential mechanisms for thrombocytopenia development with trastuzumab emtansine (T-DM1). Clinical Cancer Research 21(1): 123–133.
4. Xing et al. (2012) Selective small molecule inhibitors of p110α and δ isoforms of phosphoinosityl-3-kinase are cytotoxic to human acute myeloid leukemia progenitors. Experimental Hematology 40(11): 922-933.
5. Fares I et al. (2014) Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science 345(6203): 1509–1512.

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