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2019/11/12

共免疫沈降法(Co-IP)のコツとおすすめプロトコール

  • タンパク・核酸発現解析

ここでは共免疫沈降(Co-immunoprecipitation, Co-IP)の方法とポイントをご紹介します。

共免疫沈降(Co-immunoprecipitation, Co-IP)とは

共免疫沈降法(Co-immunoprecipitation, Co-IP)は、免疫沈降法(IP)によって標的タンパク質と相互作用する別の分子との複合体を回収する方法です(図1)。Co-IPはタンパク質相互作用の研究に欠かせない手法になっています。
サイズの大きい、あるいは不安定なタンパク質複合体を壊さず回収するために、通常のIPに加えて注意すべき点があります。

図1 共免疫沈降のワークフロー

CO-IP_scheme.jpg

Dynabeads Co-Immunoprecipitation KitをもちいたCo-IPの模式図です。
あらかじめタンパク質Xに対する抗体とカップリングしておいたビーズを、組織ホモジネートとインキュベートします。ホモジネート中のタンパク質X、およびそれと相互作用する他のタンパク質が複合体としてビーズ表面に捕捉されます。それらを溶出しゲル電気泳動で分離して検出や同定を行います。

共免疫沈降で注意すべきポイント

共免疫沈降では、タンパク質複合体に含まれる微量成分を感度良く検出しなければなりません。そのための注意するポイントは:

非特異結合を低減させる

まず、結合特異性が高い抗体を使用することが前提です。加えて、担体ビーズへの非特異結合を抑えてバックグラウンドを減らす必要があります。
セファロース/アガロースから、Dynabeadsのような均一な磁気ビーズに変更するだけで非特異結合を大幅に抑えられる場合があります。Dynabeads製品の中でも、Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kitに含まれているDynabeads M-270 Epoxyは非特異結合が極めて少ないビーズです。

複合体構造を保持する

サイズの大きい、あるいは不安定なタンパク質複合体の構造を保ったまま分離するためには反応全般において穏やかな条件下でおこなう必要があります。サンプル調製においては、サンプルに応じて界面活性剤を用いて溶解する、あるいは凍結溶解(Cryolysis)します。
免疫沈降においては、適切な組成のバッファー中での迅速な反応、穏やかな条件での洗浄、物理的ストレスの回避などが重要です。Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kitは、あらゆるタンパク質複合体の精製に最適化されたバッファーと、迅速かつストレスの少ない操作により、これらの条件をクリアしています。

抗体の共溶出を回避する

標的のタンパク質複合体を溶出する際に、ビーズに結合した抗体が共溶出するとその後の検出や解析を邪魔する場合があります。あらかじめ抗体とビーズをクロスリンク(架橋)しておくことで、溶出サンプルのコンタミネーションを低減できます。ただし、架橋により抗体の特異性や親和性が変化するリスクがあります。
クロスリンカーを使わずビーズに直接共有結合させるDynabeads Co-Immunoprecipitation Kit、あるいはDynabeads Antibody Coupling Kitはこのリスクを最小限にします。

Co-IP用のDynabeads製品、プロトコール

共免疫沈降におすすめなのが、Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kitです。
Dynabeadsへの抗体結合から、タンパク質複合体の回収までに必要なバッファーとプロトコールが含まれています(図2)。

図2 Co-IP用 Dynabeadsキットの使い分け

dynabeads_co-ip_products.jpg

※Dynabeads Antibody Coupling kitにはCo-IP用のバッファーは含まれません。また、Co-IP用 Dynabeadsキットはバッファーの別売はしておりません。

Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kit

Co-IP-kit_image.png

Dynabeads Co-Immunoprecipitation kitでは、粒径2.8 µmの均一な超常磁性ビーズ Dynabeads M-270 Epoxyの表面に任意の抗体を簡単にカップリングできます。
抗体を結合したビーズと付属のバッファーを使用して、タンパク質複合体やタンパク質-核酸複合体のCo-IPと溶出を行います。
抗体がビーズに共有結合するため、溶出サンプルへの抗体のコンタミネーションリスクを最小限に抑えられます。

Dynabeads M-270 Epoxyは、バックグラウンドの結合が極めて低く、使用前にブロッキングする必要がありません。抗体結合、穏やかな洗浄、および溶出用の8種類のバッファーは、信頼性・再現性の高い結果を得るために最適化されていますので、あらゆるサイズの複雑なタンパク質構造体を精製することが可能です。

実験を始めるのに用意するのは抗体だけです。

キットのプロトコールは、カップリング、サンプル調製(界面活性剤および凍結溶解/Cryolysis)、Co-IP、および溶出をカバーしており、ウエスタンブロット/銀染色、クーマシー染色、質量分析、あるいは単離されたDNA /RNA結合タンパク質複合体からの核酸抽出に対応しています。

Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kitの仕様

サンプルタイプ

  • 細胞
  • 組織(酵母、哺乳類、昆虫、細菌ほか)

キット構成

  • Dynabeads M-270 Epoxy
  • 8種類のバッファー(抗体結合、洗浄、溶出用)

特長

  • Co-IPに最適化された組成と分離テクノロジー
  • 非特異結合によるバックグラウンドが極めて低い
  • ビーズからの抗体溶出なし
  • 大きく不安定なタンパク質複合体の構造を保持
  • 各種プロトコールを提供

 

Dynabeads Antibody Coupling Kit

DB_antibody_coupling_kit.png

Dynabeads Antibody Coupling Kitは、Dynabeads M-270 Epoxyの表面に抗体を簡単にカップリングするための製品です。
Dynabeads Epoxyは界面活性剤のTweenを含まないため、質量分析(MS)にも適用可能です。

Dynabeads Antibody Coupling Kitの仕様

キット構成

  • Dynabeads M-270 Epoxy
  • 5種類のバッファー(抗体結合用)

特長

  • Dynabeads Co-Immunoprecipitation KitからCo-IP用バッファーを除いた構成
  • クロスリンクによる抗体親和性低下を回避
  • さまざまな下流アプリケーションに適用可能
  • 質量分析(MS)に適用可能*  *Tweenが含まれるSB bufferをTBSまたはPBSに代替

Co-IPのデータ例、参考文献

Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kitを用いて酵母から異なるリボヌクレオタンパク質(RNP)を共免疫沈降により検出した結果を以下にご紹介します(図3、出典:文献1)。
四角(青) が検出されたタンパク質、丸(赤)がバックグラウンドです。

図3 Co-IPによるRNPの検出

RNP_example.jpg

 

参考文献

  1. Oeffinger M, et al., Comprehensive analysis of diverse riboncleoprotein complexes.Nature Methods, 2007, 4(11);951-956.
  2. Alber F, et al., Determining the architectures of macromolecular assemblies. Nature 2007, 450(7170); 683-694.
  3. Alber F, et al., The molecular architecture of the nuclear pore complex. Nature 2007, 450(7170); 695-701.
  4. Cristea I, et al., Fluorescent proteins as proteomics probes.Mol Cell Proteomics, 2005, 4(12): 1933-1941.

よくある質問

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初めてIPを行いたい方や、他の方法でIPを行っていてDynabeadsによるIPを試したい方が対象です。

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