研究者紹介

林 太朗 様

株式会社エビデント

※ 所属や役職等は掲載当時のものです

研究内容

ヒトの臓器を模倣したオルガノイドは、創薬スクリーニングや疾患モデリングにおいて、ますます重要になっています。 一方で、その厚みや大きさは、顕微鏡観察における課題の一因となっています。
多くの研究者は、低倍率の対物レンズで全体像を観察した後、高倍率の対物レンズに切り替えて、その詳細構造を観察するというワークフローを採用しています。あるいは、ステッチング画像を作製して標本全体を高解像で可視化する方法もあります。
これらのワークフローにおいて、標準的なドライ対物レンズは操作性に優れるものの、オルガノイドの深部をイメージングする際には、解像度や作動距離の制約が問題となることがあります。 高解像度の3Dイメージングを実現するには、液浸対物レンズ（水浸、オイル浸、シリコーンオイル浸）を用いた共焦点顕微鏡によるイメージングが標準的手法とされています。
しかし、ステージ移動中に液浸対物レンズの浸液が切れて正常な観察ができなくなることや、液浸対物レンズでの観察後にドライ対物レンズに切り替える際、ディッシュ底面に残った浸液がドライ対物による画像劣化の原因となるといった課題もあります。

本稿では、このような課題を解決する画期的なソリューションとして、世界初のシリコーンゲル浸対物レンズ（LUPLAPO25XS）と FLUOVIEW™ FV5000 共焦点レーザー走査顕微鏡 を組み合わせた脳オル ガノイドイメージングを評価しました。従来のシリコーンオイル浸対物レンズと比較し、この光学技術がもたらす3つの利点について説明します。

方法および材料

大脳オルガノイド作製

eTeSR培地（STEMCELL Technologies）を用いて、未分化条件下で維持培養したヒト人工多能性幹細胞（hiPSC；201B7株）を、 STEMdiff Cerebral Organoid Kit（STEMCELL Technologies ）を用いて脳オルガノイドに分化誘導を行いました。
分化誘導のプロセスは、STEMdiff Cerebral Organoid Kitのプロトコルに従い実施しました。

免疫染色と透明化

オルガノイドは固定後、核染色としてDAPI、神経マーカー用の anti-TUJ1（Alexa Fluor 488）、および神経前駆細胞マーカー用の anti-PAX6（Alexa Fluor 594）を用いて免疫染色を行いました。
染色後、組織透明化試薬 SCALEVIEW-S4 を用いて、サンプルの透明化を行いました。

イメージング

結果

今回の検証実験により、シリコーンゲル浸対物レンズ「LUPLAPO25XS」と共焦点顕微鏡「FV5000」を組み合わせることで、脳オルガノイドイメージングにおける以下の課題を解決できることが示されました。

1. 安定したZスタックイメージング ： オイル切れの解消

従来のシリコーンオイル浸法では、対物レンズ先端とディッシュ底面の間が常にシリコーンオイルで満たされている必要があります。 深部までのZスタックイメージングや大きなZ軸方向のフォーカス調整を行う際、このオイルによる接触が切れてしまうことがあります。

• シリコーンオイルの課題：一度シリコーンオイルの接触が切れると、元のZ座標に戻しても、オイルが再びメニスカスを形成できないため、画像がぼやけてしまうことがあります。 その場合、オイルを補充したりレンズを再調整したりする必要があり、実験が中断されます（図１）。
• シリコーンゲルの利点：シリコーンゲル浸対物レンズの場合、レンズをディッシュから大きく遠ざけたとしても、シリコーンゲルの弾性特性による復元力があるため、目標のZ>座標に戻せばすぐに高解像度画像を取得できます。 これにより、より柔軟なフォーカス調整と再現性の高いイメージングが可能になります（図２）。

2. シームレスな対物レンズ切り替え： クリーニング不要のワークフロー

一般的な観察ワークフローでは、高解像度の液浸対物レンズで詳細な観察を行った後で、低倍率のドライ対物レンズに切り替えることがあります。

• シリコーンオイルの課題：シリコーンオイルが、ディッシュ底面に残留してしまいます。オイルを完全に拭き取らずにドライ対物レンズに切り替えると、残留オイルによる強い球面収差が発生し、不鮮明な画像の原因となります。 オイルの拭き取りは煩雑であるだけでなく、標本の位置がずれてしまうリスクもあります（図3）。
• シリコーンゲルの利点：シリコーンゲルは非流動性であるため、ディッシュ底面に残留物を残しません。 ゲル浸対物レンズからドライ対物レンズに切り替えても、画像の劣化なく観察を継続できることが可能です。 これにより、ドライ対物レンズの操作性と液浸対物の高い光学性能を兼ね備えたシームレスなワークフローが実現します（図4）。

3. マルチウェル観察： 画像ステッチングにおける安定性

ハイスループット解析では、マルチウェルプレート内の複数のオルガノイドの画像ステッチングや3Dイメージングが必要とされることがあります。

• シリコーンオイルの課題：シリコーンオイル浸対物レンズでは、ウェル間でステージを移動させると、シリコーンオイルが切れてしまい、マルチウェル撮影に失敗することがあります。 本検証においても、最初のウェルから次のウェルへ移動した時点で、オイルによる接触を維持することができず、2ウェル目以降では正常な画像を取得することが出来ませんでした（図5）。
• シリコーンゲルの利点：シリコーンゲル浸対物レンズは、ウェル間を移動させてもゲルが損傷することなく、マルチウェルプレート内のすべての対象オルガノイドを撮影することに成功しました（図6）。

結論

今回の事例では、eTeSR培地およびSTEMdiff™ Cerebral Organoid Kitを用いることで、脳オルガノイドを安定的に作製することができました。また、作製したオルガノイドは神経マーカーや神経前駆細胞マーカーの評価を含む高品質な3Dイメージングに利用できることが確認されました。 さらに、LUPLAPO25XS シリコーンゲル浸対物レンズとFV5000共焦点レーザー走査型顕微鏡を組み合わせることで、従来の液浸レンズで課題となるオイル切れや観察後の煩雑なクリーニング作業を軽減しながら、高解像度かつ再現性の高いオルガノイドイメージングを実現できることが示されました。 本事例は、STEMCELL Technologies製品を用いた脳オルガノイド作製から、その後の高度な3Dイメージング解析までの一連のワークフローを示す事例として、オルガノイド研究に取り組む研究者にとって有用な参考情報になると考えています。特に、安定したオルガノイド作製と高品質なイメージング解析を組み合わせることで、より詳細な組織評価や疾患モデル研究への応用が期待されます。

eTeSR培地とSTEMdiff Cerebral Organoid Kitを使用した感想

オルガノイドを作製するにあたり、STEMCELL Technologies社のeTeSR培地とSTEMdiff Cerebral Organoid Kitを今回初めて使用させて頂きました。STEMdiff Cerebral Organoid Kitはプロトコル通りに培地を交換しながら培養するだけでオルガノイドを作製できるため、オルガノイドの分化誘導を初めて行う私でも取り組みやすいキットでした（プロトコルの途中にあるスフェロイドをゲルに包埋する工程のみ、非常に繊細で取り返しのつかない作業のため、事前に練習しておくことが重要だと思います）。 また、当初iPS細胞の未分化維持には、先行文献で実績のある別メーカーの未分化維持培地を使用していましたが、その培地と分化誘導キットの組み合わせでは分化誘導が上手くいかず、困っていました。そこでVeritas社カスタマーサポートにご相談させて頂いたところ、細胞品質と適切な未分化維持培地（eTeSR）についてアドバイスを頂きました。細胞の品質について見直しを行い、未分化維持培地をeTeSR培地に変えることで、無事大脳オルガノイドを分化誘導させることに成功しました。改めまして感謝申し上げます。

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