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2023/07/18
神経変性・神経筋疾患モデルに ヒト運動ニューロンの作製
- 用途別細胞培養
神経変性や神経筋疾患の研究モデルに有用なヒト運動ニューロンの作製には、STEMCELL Technologies社の「STEMdiff™ Motor Neuron Kits」がおすすめです。これらの製品を使用すると、ヒト多能性幹細胞（human pulripotent stem cell: hPSC、ヒトES/iPS細胞）から、機能性の運動ニューロンへと分化誘導できます。
本稿では、製品の特長や作製したヒト運動ニューロンの解析データを紹介します。
脊髄運動ニューロン
運動ニューロン
人体には多くの種類の運動ニューロンが存在しますが、大まかに以下2つの主要グループに分けることができます。
- 上位運動ニューロン： 細胞体は脳 (運動皮質または脳幹) にあり、軸索を脊髄の下位運動ニューロンに投射します。
- 下位運動ニューロン： 細胞体は脊髄前角にあり、軸索を脊髄からエフェクター筋に投射します。脊髄運動ニューロンとも呼ばれます。
STEMdiff™ Motor Neuron Kitsを使用すると、下位運動ニューロンすなわち脊髄運動ニューロン (spinal motor neuron: spMN) を作製できます。spMNは、上位運動ニューロン、脊髄介在ニューロン、感覚ニューロンからのシナプス入力を受けます。一方、spMNは末梢のエフェクター筋にシグナルを送り、神経筋接合部 (neuromuscular junction: NMJ) と呼ばれる特殊なシナプスを形成して筋収縮を制御しています。1
spMNは個体発生においては神経外胚葉に由来し、中枢神経系 (CNS) の一部です。神経管での体軸方向のレチノイン酸 (RA) 勾配によって、脊髄への特異化が導かれます。その後、脊髄の背腹軸パターン形成によってspMN前駆体ドメインが形成され、さらにHox遺伝子発現によってspMNの体軸方向の特異化が進みます。2
spMNの研究分野
spMNは以下のような疾患と関連があります。ヒトspMNは、これらの神経疾患モデルや毒性試験を含むさまざまな用途に有用です。
- 運動ニューロン疾患： 筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄損傷 (SCI)、脊髄性筋萎縮症 (SMA)、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症など
- 神経障害： シャルコー・マリー・トゥース病など
- 神経筋接合部疾患： 重症筋無力症など
- 筋障害： 筋ジストロフィーなど
spMNへの分化方法
ヒト多能性幹細胞から運動ニューロンへのin vitroでの分化誘導法として、いくつかの代表的なプロトコール 3-5 が報告されています。これらは、in vivoで運動ニューロン発達を促すことが示されたパターン化因子の組み合わせを模倣しています。
STEMdiff™ Motor Neuron Kits は、Inserm (パリ) に所属するStephane Nedelecの研究グループが発表した、Maury et al. (Nature Biotechnology, 2015) 5 のプロトコールに基づいて開発されました。この方法では、胚様体 (embryoid body: EB) で運動ニューロンへの分化を開始し、続いて単層で成熟を行います。
STEMdiff™ Motor Neuron Kitsとは
特長
- 高効率： 簡易で拡張性のあるワークフローによって、複数のヒトES/iPS細胞（hPSC）株由来の運動ニューロン培養を合理化します
- 迅速： 運動ニューロンをわずか2週間で作製し、28日後には完全に成熟させます
- 生理的： 生理的条件の神経細胞培地 BrainPhys™を用いて、運動ニューロンを成熟させます
- 適合性： 作製した運動ニューロンは、hPSC由来の他細胞型（筋/筋管、ミクログリアなど）と共培養できます
使用方法
STEMdiff™ Motor Neuron Differentiation Kit を用いて、hPSCから14日間で運動ニューロンを作製した後、STEMdiff™ Motor Neuron Maturation Kit でさらに14日以上培養して成熟させます。各1キット使用時に、約107個のニューロンを長期培養（30日以上）で作製可能です。
最初に推奨されるプロトコール（図1）では、0-9日目のEB形成・分化段階をAggreWell™400 24-well Plate (ST-34411) で実施します。AggreWellプレート表面に刻まれた400 µmのマイクロウェル中で、非常に均一なサイズのEBが形成されます（図2）。培養のスケールアップ向けには、AggreWell™400 6-well Plateを使用するプロトコールもございます。
一方、AggreWellの代替として、超低接着6-wellプレートを使用するプロトコールもございますが、収量はAggreWellと比べて低くなります。
図1. STEMdiff™ Motor Neuron培養系による運動ニューロン分化・成熟の流れ
図2. AggreWell™400プレート内で運動ニューロンに分化中のEB
運動ニューロン分化に伴うマーカー発現
9日目のマーカー発現
- 通常、運動ニューロン前駆体マーカー OLIG2 (>80%) を発現します（図3）
- 最小限の脊髄介在ニューロンマーカーまたは前脳ニューロンマーカー (NKX2.2、FOXG1、OTX1、OTX2など) を発現します（図3）
- HOXA2、HOXA4、HOXA5が高発現し、より吻側（頸髄）の運動ニューロン生成を示唆します（図4）
図3. 高純度の運動ニューロン前駆体
(A) STEMdiff™ Motor Neuron Differentiation Kitをもちいて各種のhPSC株から形成したEBを9日目に解離し、シングルセルとして接着培養に播種しました。得られた培養物には、運動ニューロン前駆体マーカー OLIG2（赤）を発現し、脊髄介在ニューロンマーカー NKX2.2（緑）を発現しない細胞集団が含まれています。細胞核はHoechst（青）で標識されています。
(B) OLIG2およびネガティブコントロール (NKX2.2、FOXG1、OTX1、OTX2) の発現頻度 (%) を定量化しました。
図4. 頸部にパターン化された運動ニューロン
STEMdiff™ Motor Neuron Differentiation Kitをもちいて作製したhPSC由来の運動ニューロン前駆体（9日目）の遺伝子発現をqPCRにより測定しました。コントロールとしてhPSC由来の前脳ニューロン前駆体を使用しました。運動ニューロン前駆体はhPSCに比べて前後軸の頸部を示すHOXA5を高発現しています。
14日目のマーカー発現
- 以下の基準に従って運動ニューロンを評価し、実験継続の可否を判断します（図5）
>80% β-tubulin +
>40% ISL1 +
>40% NKX6.1 + - 通常、運動ニューロンマーカー HB9も40%以上発現します（図5）
- この時点では未成熟なため、14日間の追加培養後にマーカー発現の再評価が必要です
図5. 有糸分裂終了後の運動ニューロン
(A,B) hPSC由来の運動ニューロン前駆体をSTEMdiff™ Motor Neuron Differentiation Kitをもちいて分裂終了した運動ニューロン（14日目）へと移行させました。得られた培養物には、神経同定マーカー βIII-TUB（A、緑）、成熟運動ニューロンマーカー HB9（A、赤）およびISL1（B、赤）、を発現する細胞集団が含まれています。細胞核はHoechst（青）で標識されています。
(C) 遺伝子発現を定量化しました。
28日目のマーカー発現
- 以下の基準に従って運動ニューロンを評価し、分化の成功を判断します（図6）
>80% β-tubulin +
>40% ISL1 +
>40% HB9 +
>40% ChAT + - 運動ニューロンマーカー ISL1、HB9、および成熟運動ニューロンマーカー ChAT（コリンアセチルトランスフェラーゼ）の発現が重要です（図6, 7）
図6. 成熟後の運動ニューロン
(A-C) hPSC由来の運動ニューロンをSTEMdiff™ Motor Neuron Maturation Kitをもちいて成熟させました（28日目）。得られた培養物には、神経同定マーカー βIII-TUB（A、緑）、成熟運動ニューロンマーカー HB9（A、赤）、SYNAPSIN（B、赤）、MAP2（B、緑）、およびコリン作動性ニューロンマーカー ChAT（C、緑）を発現する細胞集団が含まれています。細胞核はHoechst（青）で標識されています。
(D) 遺伝子発現を定量化しました。
図7. コリン作動性ニューロンの産生
hPSC由来の成熟運動ニューロン（28日目）の遺伝子発現をqPCRで測定しました。コントロールとしてhPSC由来の前脳ニューロンを使用しました。成熟運動ニューロンはChATを高発現しています。
運動ニューロンの共培養
ミクログリアとの共培養
- 運動ニューロンを、STEMdiff™ Microglia Differentiation Kit (ST-100-0019) で作製したhPSC由来ミクログリアと共培養できます
- ミクログリアとの相互作用は、ALSなどの運動ニューロン疾患の神経炎症に関する研究対象となります
- ミクログリアと運動ニューロンをhPSCから別々に分化させた後、ミクログリアを未成熟運動ニューロンに1:2（ミクログリア:ニューロン比）で播種し、BrainPhys™ベースの培地で共培養します
図8. 運動ニューロンとミクログリアの共培養
筋管との共培養
- 運動ニューロンをhPSC由来筋管と共培養することで、神経筋接合部の形成をin vitroで研究できます
- 筋管は、STEMdiff™ Myogenic Progenitor Supplement Kit (ST-100-0151)、MyoCult™-SF Expansion Supplement Kit (ST-05980)、およびMyoCult™ Differentiation Kit (ST-05965) をもちいてhPSCから作製します
- 運動ニューロンは、分化14日目までEBのまま培養し、シングルセルに解離してから筋管に播種します
- 共培養は、STEMdiff Motor Neuron Maturation Mediumで10-14日間維持されます
- アセチルコリン受容体 (AChR) は点状に染色され、神経筋接合部の存在を示します
図9. 運動ニューロンと筋管の共培養
共培養について詳しくは：
以下の学会発表ポスター、Figure 4をご参照ください。
SP00265-Rapid, High-Efficiency Differentiation of Motor Neurons from Human Pluripotent Stem Cells
運動ニューロンの神経活性測定
多電極アレイ (MEA)
- 神経活性をMEAで測定し、運動ニューロンの成熟と機能を評価することができます
- 成熟段階（14日目以降）の進行に伴い、平均発火率で測定される神経活性が上昇します
- 以降42日目までの活性上昇が確認されています
図10. MEAによる運動ニューロン活性測定
参考文献
- Stifani N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 2014 Oct 9;8:293.
- Brandi N. Davis-Dusenbery, Luis A. Williams, Joseph R. Klim, Kevin Eggan; How to make spinal motor neurons. Development 1 February 2014; 141 (3): 491–501.
- Klim JR, Williams LA, Limone F, Guerra San Juan I, Davis-Dusenbery BN, Mordes DA, Burberry A, Steinbaugh MJ, Gamage KK, Kirchner R, Moccia R, Cassel SH, Chen K, Wainger BJ, Woolf CJ, Eggan K. ALS-implicated protein TDP-43 sustains levels of STMN2, a mediator of motor neuron growth and repair. Nat Neurosci. 2019 Feb;22(2):167-179.
- Du ZW, Chen H, Liu H, Lu J, Qian K, Huang CL, Zhong X, Fan F, Zhang SC. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 2015 Mar 25;6:6626.
- Maury Y, Côme J, Piskorowski RA, Salah-Mohellibi N, Chevaleyre V, Peschanski M, Martinat C, Nedelec S. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nat Biotechnol. 2015 Jan;33(1):89-96.
