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2020/10/01

iPS細胞から単球へ誘導する革新的なアプローチ「STEMdiff Monocyte Kit」

  • 用途別細胞培養

「STEMdiff™ Monocyte Kit」(商品コード:ST-05320)は、フィーダーフリーかつ無血清の培養条件下でヒト多能性幹細胞(hPSC、ヒトES/iPS細胞)から単球への分化を促進します。
本製品を用いて作成した単球は、同じSTEMCELL Technologies社の「ImmunoCult™-SF Macrophage Medium」(商品コード:ST-10961)または「ImmunoCult™ Dendritic Cell Culture Kit」(商品コード:ST-10985)を用いて、マクロファージまたは樹状細胞へそれぞれ分化させることが可能です。

単球の機能と培養

単球は白血球の一種で、マクロファージや樹状細胞に分化する能力があります。単球とその分化細胞は、主に食作用(貪食)・抗原提示・サイトカイン産生といった機能を持ち、病原体や腫瘍に対する防御を提供する自然免疫の必須コンポーネントであると同時に適応免疫にも関与しています。
単球はヒト末梢血から分離できますが、iPS細胞由来の単球培養系を構築することにより、単球とその分化細胞のロット間差を抑えつつ大量供給することが可能になります。iPS細胞由来の単球は、疾患モデリング、細胞治療アプリケーションの開発、および基礎生物学の研究への応用が期待されています。
STEMdiff™ Monocyte Kitは、ヒトiPSおよびES細胞から高効率に単球を分化誘導できます。培養には間質細胞(フィーダー細胞)や血清を一切使用しないので再現性が確保できます。

STEMdiff Monocyteの特長

主な特長

  • 効率的 ― わずか14〜23日で、プレートあたり最大700万個のCD14+単球を生成
  • 安定的 ― 無血清・フィーダーフリー培養のため、血清やフィーダー細胞による変動要素を排除
  • 簡便 ― シンプルな単層培養で、単球は浮遊細胞として容易に回収
  • 汎用性 ― 複数のESおよびiPS細胞株から単球を効率的に誘導可能

STEMdiff Monocyte Kit

STEMdiff Monocyteの使用方法

iPS細胞から単球への分化誘導ワークフロー

図1

  • 分化を開始する1日前に、ヒト多能性幹細胞(hPSC)のコロニーを回収し、mTeSR™1、TeSR™-E8™、またはmTeSR™ Plus培地で小さな凝集体(直径100〜200 μm)として10〜20個/cm2の密度で播種します。
  • Stage 1: 1日後、培地をMedium A(STEMdiff™ Hematopoietic Basal Medium + Supplement A)に交換し、中胚葉への特異化を誘導します。
  • Stage 2: 3日目に、培地をMedium B(STEMdiff™ Hematopoietic Basal Medium + Supplement B)に交換し、造血系への特異化を促進します。
  • Stage 3: 7日目から、培地を単球分化培地(StemSpan™ SFEM II + STEMdiff™ Monocyte Differentiation Supplement)に交換し、CD14+単球の産生を促進します。14日目以降の浮遊液からCD14+細胞が検出され、その頻度は17〜23日目まで徐々に増加します。培地交換時に、培養上清からCD14+細胞を直接回収できます。

STEMdiff Monocyteのデータ

最大60-80%の細胞がCD14陽性単球へ分化します

図2

培養17〜23日目の間(図1)、2〜3日ごとに細胞を回収し、フローサイトメトリーでCD14発現を分析しました。
ピーク収穫時では、生存するCD14+単球の平均頻度は61〜78%で、6ウェルプレートあたりのCD14+単球の平均収量は1.6 x 106〜7.1 x 106細胞でした。データは平均±SEM(n = 3-14)で示しています。

生成された単球は貪食能を持つマクロファージへの分化が可能です

図3

培養21日後(図1)にhPSC由来単球を回収し、100 ng/mL M-CSFを含む ImmunoCult™-SF Macrophage Medium(ST-10961)を使用して4日間培養しマクロファージへ分化させました。マクロファージはさらに2日間、10 ng/mL LPSと50 ng/mL IFN-γ、または10 ng/mL IL-4とともに培養することで、それぞれM1またはM2aマクロファージへ分化させました。

貪食能を測定するため、PSC由来M2aマクロファージおよび末梢血(PB)単球由来M2aマクロファージ(初代M2aマクロファージ)をpHrodo™ Red Zymosan A BioParticles® Conjugateとインキュベートし、37℃で8時間培養しました。30分ごとにIncuCyte® ZOOMを使用して画像を取得し、pHrodo™ Red Zymosan A BioParticles®の内部移行を分析しました(赤色物体/mm2として測定)。

PSC由来M2aマクロファージは、初代M2aマクロファージと同様の貪食活性を示しました。

生成された単球は樹状細胞への分化が可能です

図4

培養21日後(図1)にhPSC由来単球を回収し、ImmunoCult™ Dendritic Cell Culture Kit(ST-10985)を使用して樹状細胞に分化させました。
(A)樹状細胞の半分は7日目に回収してCD14とCD83の発現を調べ、CD14⁻CD83⁻/lo未成熟樹状細胞を特定しました。
(B)残り半分の樹状細胞は2日間活性化し、7日目にCD14⁻CD83⁺成熟樹状細胞の存在を評価しました。
データはES細胞(H9株)から開始した代表的な培養結果を示しています。

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