ラーニングコーナー
2020/12/17
StemSpan SFEM IIとUM729を使用したCD34陽性細胞の無血清培養増殖
- 用途別細胞培養
STEMCELL Technologies社では以前、CD34陽性細胞の増殖に使用されるサプリメントについて取り上げました（こちらを参照）。この技術ヒント集では、無血清の条件下でCD34陽性細胞の大量培養するためのStemSpan™ SFEM II培地、StemSpan™ CD34+ Expansion Supplement、そして各種小分子の利用についてより深く掘り下げてゆきます。これらを利用した培養条件下では、未熟なCD34+CD45RA-CD90+前駆細胞を7日後に10倍以上にまで増殖させることができます。
併せてこちらも（https://www.stemcell.com/serum-free-expansion-of-cd34-cells-with-sfem-ii.html）ご確認ください。
ご準備いただくもの：
- CD34陽性細胞（新たに分離した、または凍結保存していたサンプル）
- StemSpan™ SFEM II Medium
- StemSpan™ CD34+ Expansion Supplement
- Falcon 96-Well Flat-Bottom Microplate*
- オプションとして: UM729 **
*必要な製品サイズ、フォーマットは実験の規模により決定します。下のTable１をご参照してご検討ください。
** UM171を終濃度175 nMになるように添加して使用した場合にも、（UM729終濃度 1μMの場合と）同等の結果が得られます。
ステップ1. CD34陽性細胞の取得
CD34陽性細胞は凍結細胞の購入（こちらを参照）や、凍結保存後または新鮮な臍帯血(CB)や骨髄（BM)からの分離により得ることができます。
スタートサンプルを得る方法を検討する際に、下記のような疑問が生まれるかもしれません：
- 新鮮な細胞と凍結保存されたプライマリー細胞、どちらを使ったら良いか？
新鮮な細胞、凍結保存されたCD34陽性細胞いずれも増殖に用いることができます。サンプルに造血前駆細胞が十分に含まれており、全体としての品質や生存率が良好であればどちらの細胞でも望ましい結果を得ることができます。細胞品質の差異は、同じドナーにおける新鮮・凍結保存サンプル間よりも、異なるドナー由来のCBサンプル間の方が大きい場合が多く見られます。通常、「高品質な」CBサンプル由来の凍結保存細胞の方が、「品質が良くない」CBサンプル由来の新鮮細胞よりもより良い結果が得られます。 - 新鮮または凍結保存された全血およびBMのサンプルを持っている。CD34陽性細胞を分離するためにはどのEasySep™キットを使用したら良いか？
ご自身のサンプルに合った細胞分離製品の選択に関するさらに詳細な情報については、STEMCELL Technologies社の過去の技術ヒント集「造血前駆細胞の分離 (Isolating Hematopoietic Progenitors)」をご参照下さい。CD34陽性細胞を新鮮CBより分離する際には、EasySep™ Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit IIをお使いいただきましたら、キットがCBの分離に最適であることをご実感いただけるかと思います。
ステップ2. 培養系のセットアップ
CD34陽性細胞は、SFEM II 培地を使って培養器のタイプやサイズに関わらず増殖させることができます。下のTable１ は、3種類の推奨培養器フォーマットにそれぞれ幾つのCD34陽性細胞を播種すれば良いかを決定する際にお使い頂けます。数値はあくまでガイドラインとしての値であり、実験の目的や細胞の品質により適した培養フォーマットや細胞濃度は異なります。
Table１. 各種培養プレートフォーマットにおけるCD34陽性細胞の一般的な推奨播種濃度
*培養器は付着細胞培養用（Tissue culture-treated）でも浮遊細胞培養用（Non- tissue culture-treated）でもお使い頂けます。いずれもCD34陽性細胞の増殖に対する影響は確認されておりません。
**StemSpan™ CD34+ Expansion Supplementは10xのものが10 mLで販売されております。これは、90 mLのSFEM IIに添加して1x としてご使用いただける分量です。
培養の推奨プロトコール
Day 0 - Table1の推奨条件を参照し、CD34陽性細胞をSFEM IIベースの培地（10 mLのStemSpan™ CD34+ Expansion Supplement（10X）を90 mLのSFEM IIに添加したもの。UM729の添加あり（終濃度1μM*）または添加なし）に懸濁してプレーティングします。下のFigure１で示すように、造血幹細胞の増殖に関連する小分子であるUM171も175 nMにてご使用頂くことが可能です。
Day 7 - 評価または培養後のアプリケーションに使用するため、細胞を回収します。
ご注意：7日間という培養期間は、細胞の回収率、CD34の発現、前駆細胞の機能の観点から最良のタイミングとして決定されています。細胞の回収率よりもCD34発現や前駆細胞機能の温存を優先する場合には、培養期間をより短くする場合があります。細胞の回収率を最優先する場合には、培養期間を7日以上にすることも可能です。培養期間が長くなるにつれて細胞の分化が起こってくるため、CD34の発現や前駆細胞としての機能は低下する点にご注意ください。 7日間以上CD34陽性細胞を培養する場合には、サプリメント入りの培地を使って培養4日目にフィード、7日目には細胞の希釈や播き直しをおこない、細胞の増殖と生存を維持します。培養系へのフィードは培養4日目に培養中の培地と等量のサプリメント入り培地を添加する、または半量の培地交換をすることによりおこないます。
*特定の条件下では、細胞増殖を最適化するためにさらに条件検討が必要になる場合があります。
ステップ3. 培養後のアプリケーションへの利用とデータの定量化
培養後には、トリパンブルーと血球計算盤や自動セルカウントを使用してトータル細胞数と生細胞数をカウントし、フローサイトメトリーで細胞のCD34発現を測定することをお勧めします。CD34陽性細胞のサブセット、培養の間に生じた分化細胞（CD34陰性細胞）を同定するためにさらなるイムノフェノタイピングが必要になる場合もあります。イムノフェノタイピングや蛍光活性化セルソーティング（FACS）のためのさらなる詳細情報については、STEMCELL Technologies社のポスター「ヒト造血幹細胞・造血前駆細胞のフェノタイプ」をこちらからリクエストしてご参照下さい。
ご注意：培養期間中CD34陽性細胞上の抗原(CD34)の発現は変動するため、培養されていない細胞のCD34発現のように細胞の分化段階や多分化能の指標として使用するには適当でない可能性があります。例えば、CD38を低レベルに発現している、または発現していないプライマリーのCD34陽性細胞（CD34+CD38-）には造血幹細胞や初期の造血前駆細胞が豊富に含まれますが、増殖培養期間中に検出されるCD34+CD38-細胞はそのような未熟な細胞ではない、といった事があります。
期待される成果
CD34+ Expansion Supplement を添加したSFEM IIは、培養によるCD34陽性細胞の増殖をサポートします。UM729やUM171を添加すると、CD34+CD45RA-CD90+細胞のようなより初期のサブセットのみならず、CD34陽性細胞の増殖もさらに亢進します（培養7日目においてこれら小分子を含まない培養系と比較すると、~10倍程度亢進します）。
Figure 1. StemSpan™ SFEM II中で培養したCD34陽性細胞の増殖
CD34陽性細胞は CD34+Expansion Supplement (Exp) のみを含んだSFEM II、またはこれに加えてUM171を終濃度175 nMで含有する培地中で培養しました。類似した結果はUM729を終濃度1 μM で使用した場合にも得られています。図で示されているのは、それぞれ培養7日後の総有核細胞(TNC)、CD34陽性細胞、CD34+CD45RA-、CD34+CD45RA-CD90+細胞の細胞数の平均値です。データは平均値± SEM (n = 7)で示されています。P値は両側検定のStudentのt検定（two-tailed paired Student’s t-test）を用いて算出されています(*P < 0.05; **P < 0.01)。
Ex vivo（生体外）で増殖したCD34陽性細胞はコロニー形成ユニット(CFU)アッセイでのプレーティング（こちらを参照）、iPS細胞へのリプログラミングなど様々なアプリケーションへの利用に適しています。
製品サポート等については下記お問い合わせフォームより承ります。
この技術ヒント集はSTEMCELL Technologies社のHematopoiesis Hubの中にも掲載されています。ぜひこのサイトを訪れて、従来製品や新製品についての便利な情報の入手、各研究分野のエキスパートたちとの意見交換、ウォールチャートのリクエストなどにお役立てください！
