FAQ
- タンパク・遺伝子発現解析
- Dynabeads Streptavidin M280を使用して固相cDNAライブラリーを作成し、PCRを行っています。Dynabeads Streptavidin M280とビオチン化cDNAの結合の熱安定性（耐熱性）のデータはありますか？
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高温（>80℃）で長時間の加熱で、ストレプトアビジン自体が変性してしまいますが、ビオチンに結合したストレプトアビジンは、より安定で、ビオチン化cDNA結合ビーズでPCR可能です。
＜加熱時のストレプトアビジン結合ビーズの安定性＞
ビーズの入った溶液と、高温に保つ時間の長さに依存します。80℃以上の高温での長時間の加熱では、ストレプトアビジン自体が壊れる可能性があります。重要なのはストレプトアビジンと4つのビオチン結合サイトを傷つけないようにすることです。ストレプトアビジンタンパクはビオチン分子とひとたび結合すると、より安定になります。従って、 固定されたDNAとともに、ストレプトアビジンビーズをPCRに用いることは可能となります(各サイクルで30秒間の繰り返し加熱）。
＜ストレプトアビジン-ビオチン相互作用の安定性＞
ビオチン化された分子の長さにも依存します。たとえば、ストレプトアビジンビーズに固定されたビオチン化された長いDNAフラグメントを扱う場合は、短いDNAフラグメントが固定されている場合に比べ、加熱すると相互作用がより不安定になる可能性があります。
＜ビオチン化されていないストランドDNAの溶出＞
ビオチン化されているものとされていないもの分離は、アルカリ処理と温度処理の2つの方法で行います。アルカリ処理を行う場合、ビオチン化されていないストランドDNAを0.1MのNaOHで溶出させることができます。この処理は、ビーズに対して何の影響も及ぼしません。プロトコルは以下の通りです。
1) NaOH処理の前にDynabeads/DNA 複合体を2 x B&W バッファーで一度洗浄し、上清を取り除きます。高塩濃度にすることで電荷を減らし、非特異結合を最小限に抑えることができます。
2)新たに作った(重要)0.1M NaOHを Dynabeads/DNA 複合体に加え、室温で、2-5分インキュベートします。（回転させながらインキュベートすることをお勧めします。）ビオチン化されていないストランドDNAを含む上清を取り除きます。
3)Dynabeads/DNA 複合体をさらにもう一回 0.1M NaOHで洗浄し、上清を取り除きます。ほとんどのビオチル化されていないストランドDNAは、最初の溶出で溶出されます。
アルカリ処理の代わりに、95℃で5分間加熱する方法もあります。これは、再アニーリングを防ぐために、始めに分離する必要があります（氷上が望ましい）。加熱は数%のビオチン化DNAが(水の場合約7%) がストレプトアビジンと解離してしまう事がありることに注意してください。従って、通常はアルカリ処理をおすすめしております。関連リンク：
ストレプトアビジン-ビオチン複合体の解離・溶出について - Dynabeads情報
関連リンク：
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