STEMCELL Technologies HepatiCult HepatiCult Mouse Organoid Medium
- 研究用
HepatiCult™ Organoid Growth Medium (Mouse) は、マウスの肝前駆細胞オルガノイドを樹立し維持する、組成が明確な無血清培地です。「ミニ肝臓」とも呼ばれるこれらのオルガノイドは、肝幹細胞および前駆細胞の研究にin vitro 器官培養系として使用できます。
本品で培養した肝臓オルガノイドは、肝幹細胞および前駆細胞（PROM1、AXIN2、SOX9、CD44）、胆管（KRT19、HNF1b）、ならびに肝細胞（HNF4a、AFP）のマーカー遺伝子を発現する上皮を特徴とします。肝臓オルガノイドは4〜7日ごとに継代でき、凍結保存可能で、下流の分化に利用できます。
本品は、オルガノイドをCorning® Matrigel®ドームに包埋、またはMatrigel®希釈液に懸濁する培養法に対応しています。オルガノイド培養は、生理学的関連性のあるin vitro 条件下で肝上皮の特性解析を実施でき、動物使用の必要性も減らせます。
本品はHUBとの共同開発製品です。商業目的で使用する場合は、HUB（www.huborganoids.nl/）へご連絡の上、商用ライセンスまたはHUBとのライセンスに関する説明を受けてください。
2018/05/14 12:00の製品情報
本製品は研究目的にのみ使用し、人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないようにご注意ください。
製品の特長
HepatiCult Mouse Organoid Growth Medium（OGM）でマウス肝前駆細胞オルガノイドを樹立、維持
- 肝臓オルガノイドを4～5日で作製する、便利な in vitro 培養系
- 肝障害モデル、手作業の胆管単離、セルソーティングが不要のプロトコル
- 製品仕様がシンプル、組成が明確な無血清培地
- マトリックスドーム内または懸濁培養のどちらでもオルガノイドの樹立と維持が可能
対象のアプリケーション
- 肝幹細胞・胆管上皮細胞の研究
- 肝細胞がん・肝疾患モデルの研究
- 創薬毒性試験
マウス肝オルガノイド作製の流れ
- 解剖したマウスの肝臓組織を細かく切断して、酵素消化バッファー（EDB: Enzymatic Digestion Buffer）で消化します（37℃、2時間）。
- 消化した胆管をペレットにしてマトリゲルに埋め込みます。
【A】 ドーム培養の場合、温めた24ウェルプレート中央に30 μLのMatrigelドームとして播種します。ドームを37℃、10分間凝固させ、750 μLのHepatiCultを加えます。
【B】 懸濁（浮遊）培養の場合、10% Matrigel、90% HepatiCult（冷）に混合し、振盪器で撹拌（80 rpm）しながら37℃まで徐々に温めます。 - 7日後に肝オルガノイド培養が確立されたら、オルガノイドを機械的に破砕して断片化し、任意の密度（平均分割比1:25）で播種して継代します。
データ紹介
オルガノイドは様々な肝臓試料から作製可能
HepatiCult™ Mouse OGMでは（A）胆管断片（B）シングルセル（C）凍結オルガノイドから肝臓オルガノイド培養を開始できる。いずれもMatrigelドーム内で培養したもので、初代培養7日目または、凍結オルガノイドの場合は解凍後の初回継代時に撮影した。
Matrigelドームまたは希釈Matrigel懸濁液で培養
HepatiCult™ Mouse OGMで（A）Matrigelのドーム培養または（B）希釈Matrigelの懸濁培養により得たマウス胆管断片由来の肝前駆細胞オルガノイド。いずれの培養条件下でも、オルガノイドは4～7日以内に継代できる。
成熟した肝上皮の典型的特徴を示すオルガノイド
（A）肝前駆細胞オルガノイドは、肝上皮に典型的な多角形の形態を示す。
（B）オルガノイド培養された肝前駆細胞は、成熟肝細胞に共通する特徴の二核性（▼印）を示す。
（C）免疫細胞化学分析では、オルガノイドの外面に沿ってMRP4（膜結合型の一方向流出輸送体）（緑）の局在が見られる。細胞核をDAPI（赤）で対比染色した。
（D）活発に分裂する前駆細胞集団（Ki67遺伝子発現（赤））が含まれる。核染色をDAPI（青）で対比染色した。
ドーム培養および懸濁培養したオルガノイドの遺伝子発現
HepatiCult™ Mouse OGMを用いて、Matrigelドーム培養および懸濁培養した肝臓オルガノイドのマーカー発現をRNA-seqで解析したところ、いずれも肝幹細胞および肝前駆細胞の関連マーカーを発現していた。また、胆管細胞や肝細胞などの成熟肝細胞型の関連遺伝子も低レベルに発現していた。各列は、継代1~40回における生物学的反復を表す。
肝前駆細胞オルガノイドの増殖
HepatiCult™ Mouse OGMで培養したオルガノイドは、継代を経ても効率よく増殖し、継代あたりの平均分割比は1:25となった。
肝前駆細胞オルガノイドの分化
HepatiCult™ Mouse OGM（EM）で培養した肝前駆細胞オルガノイドは、分化培地（DM、文献で報告された組成）に切り替えるとより成熟した細胞型へ分化する。DMに切り替え後のオルガノイドは、成熟肝細胞マーカー (A) Hnf4α 、(B) Alb、および胆管マーカー (E) Krt19、(F) Hnf1β の発現が上昇し、肝幹・前駆細胞マーカー (C) Sox9、(D) Axin2 の発現が低下した。
各マーカーの相対定量（RQ）は、ハウスキーピング遺伝子の18SおよびTBPとの相対値として、HepatiCult™ Mouse OGMでドーム培養した肝前駆細胞オルガノイドに対し正規化している。
