製品の特長

ImmunoCult™ NK Cell Expansion Kitで、NK細胞を効率よく拡大培養！

• ヒトNK細胞を強力に増幅し、高収量・高純度のNK細胞を取得
• 血清やフィーダー細胞を使わずに培養
• 細胞傷害能力のある機能性のNK細胞を増殖

NK細胞増殖の流れ

図1. ImmunoCult™のNK細胞増殖プロトコル
ヒトナチュラルキラー（NK）細胞を、血液または白血球アフェレーシスサンプルからEasySep™を用いて分離し、ImmunoCult™ NK Cell Expansion Mediumで培養する（ImmunoCult™ NK Cell Expansion Coating Materialでコートした培養プレートを使用）。3日後に新鮮培地を追加する。培養開始から7日目と、10または11日目に増殖中のNK細胞を採取し、新たにコートしたプレートに再播種する。増殖したNK細胞を14日目に採取し、下流のアッセイに用いる。

データ紹介

図2. CD56+CD3- NK細胞は、フィーダーも血清もない培養条件下で14日以上増殖
単離したヒトCD56+CD3- NK細胞をImmunoCult™ NK Cell Expansion Kitで14日間培養した（図1）。細胞を採取し、特徴的なNK細胞マーカー（CD56, CD3, CD16, CD94, KIR, NKG2D, NKp46, NKp30, NKp44）の発現をフローサイトメトリーで解析した。KIR（killer cell immunoglobulin-like receptor）の染色には、異なるKIR分子を認識する2つの抗体クローン（HP-MA4、180704）を用いた。死細胞は光散乱プロファイルとDRAQ7™染色により除外した。
（A - H）代表的なフローサイトメトリープロット。
（I）14日目の生存するCD56+CD3-およびCD56+CD16+NK細胞の平均頻度は、それぞれ87 ± 1%および75 ± 2%だった。CD56+CD3-細胞の平均増殖倍率は89 ± 17であった。結果は平均 ± SEMで示した（n = 34）。

図3. 増殖したNK細胞は機能性で、共培養でK562細胞を殺傷
単離したCD56+CD3- NK細胞を図1で示すように増殖させた。増殖したNK細胞とK562細胞（Incucyte® Cytolight Rapid Dyeで標識）を1:1の比率で、37°Cで4時間、共培養した。カスパーゼ誘導色素のIncucyte® Caspase-3/7 Dyeを共培養に加え、K562細胞のカスパーゼ誘導性アポトーシスを検出した。Incucyte®イメージングシステムで1時間ごとに取得した画像を解析し、殺傷率（アポトーシスK562細胞数 ÷ 総標識K562細胞数）を算出した。4時間後、平均で48 ± 2.4%のK562細胞が死滅した（n = 9）。データは平均 ± SEMで示した。

図4. 増殖したNK細胞は刺激後に脱顆粒し、サイトカインを産生
単離したCD56+CD3- NK細胞を14日間増殖させた（図1）。増殖したNK細胞を刺激せず放置するか（対照群）、PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）とイオノマイシン、またはK562細胞（エフェクター：ターゲット細胞の比率1:1）のいずれかで刺激した。CD107a抗体を加え、37°Cで4時間インキュベートした。最初の1時間後、モネンシンとブレフェルディンAを加えた。細胞をフローサイトメトリーで解析し、表面のCD56、CD107aおよび細胞内のIFN-γ, TNF-αの発現を評価した。
（A-C）未刺激（灰）、PMAとイオノマイシン刺激（橙）、K562刺激（紫）後のNK細胞の、CD107a、IFN-γ、TNF-α発現の代表的ヒストグラム。
（D）脱顆粒マーカーである表面CD107aを発現するNK細胞の平均頻度は、未刺激対照群で23 ± 5%、PMAとイオノマイシン刺激後に88 ± 5%、 K562細胞刺激後に74 ± 6%。
（E）細胞内IFN-γを発現するNK細胞の平均頻度は、未刺激対照群で10 ± 2%、PMAとイオノマイシン刺激後に75 ± 4%、K562細胞刺激後に48 ± 4%。
（F）細胞内TNF-αを発現するNK細胞の平均頻度は、未刺激対照群で6 ± 4%、PMAとイオノマイシン刺激後に85 ± 1%、K562細胞刺激後に45 ± 4%。データは平均 ± SEMで示した（n = 6 - 13）。