製品の特長

StemSpan™ NK Cell Generation Kitで、無血清条件下でヒトCD34陽性細胞をNK細胞へと分化誘導

図1. NK細胞への分化誘導プロトコール 概要

CB由来CD34⁺細胞を播種し、培養3〜4日後に培地を補充し、その後3〜4日ごとに培地を半量ずつ交換します。
培養してから14日目にリンパ系前駆細胞期の細胞を回収し、NK細胞へさらに分化させるため再播種します。回収と再播種の後、3〜4日ごとに培地の補充と半量交換します。
注：UM729はNK Cell Differentiation Mediumにのみ添加し、Lymphoid Progenitor Expansion Mediumには添加しません。

データ紹介

図2. 28日間培養した後のCD56⁺ NK細胞の頻度と収量

CB由来CD34⁺細胞（新鮮または凍結）をStemSpan™ NK Cell Generation Kitで28日間培養しました。培養した細胞を回収し、フローサイトメトリーにより（A, B）CD56および（A）NKp46の発現を解析しました。死細胞は光散乱プロファイルおよび生細胞染色により除外しました。（B）28日目の生存CD56⁺NK細胞の平均頻度は77％で、CB由来CD34⁺ 細胞1個あたり約9,000のCD56⁺細胞が産生されました。95％の信頼区間（n = 45：新鮮と凍結サンプルそれぞれ23個と22個）の平均を示しています。BM由来CD34⁺細胞も同キットでNK細胞に分化させました。BMからのNK細胞の収量は一般にCBより低く、CD34⁺ 細胞1個あたり平均で約75個でした（n = 3、データ非表示）。

図3. 28日間培養した後のCD56⁺ NK細胞の表面マーカー発現

CB由来CD34⁺細胞をStemSpan™ NK Cell Generation Kitで28日間培養しました。分化した細胞を回収し、CD56、NKp44、NKp30、NKG2D、CD94、CD16、KIRの発現をフローサイトメトリーで解析しました。KIR分子の染色は、それぞれがKIR分子の異なるサブセットを認識する抗体の2つのクローン180704とHP-MA4を組み合わせて実施しました。

図4. K562細胞株に対する培養NK細胞の細胞毒性

CB由来CD34⁺細胞からNK細胞を図1のプロトコールにしたがい作製しました。培養28日目に細胞を回収してCD56を染色し、生存するCD56⁺細胞を計測しまいた。K562細胞を8 μMカルセインAMとともに37℃で1時間インキュベートし2回洗浄しました。次に、CD56⁺NK細胞をエフェクター：ターゲット比5：1でカルセインAM標識K562ターゲット細胞10,000個と合わせ、U底96ウェルプレートで37℃、4時間共培養しました。EasySep™で分離した成人末梢血（PB）由来NK細胞および単球を、それぞれ陽性および陰性コントロールとして使用しました。PB NK細胞はNK Cell Differentiation SupplementとSFEM IIとともに、PB単球はSFEM IIのみでそれぞれ一晩培養しました。自然放出を検出するため、カルセインAM標識K562ターゲット細胞のみを含むコントロールウェルを設定しました。標識K562細胞を1％ Triton™ X-100で処理して最大放出を測定しました。インキュベーション後、プレートを500 x gで5分間遠心分離し、100 μLの上清を黒色プレートに移し、SpectraMax®マイクロプレートリーダー（励起485 nm /発光530 nm）で解析しました。結果は% specific lysisとして表しました。：[（試験放出 - 自然放出）x 100] /（最大放出 - 自然放出）。
CB CD34⁺由来NK細胞はPB NK細胞と比較して、K562ターゲット細胞に対して同様の殺傷活性を示します。平均値±SD（CB CD34⁺ 由来NK細胞：n = 18、PB NK細胞および単球：n = 7）を示しています。