研究者紹介

梶谷 卓也　先生

奈良県立医科大学　医学部生理学第二講座　研究助教

研究室のホームページ

※ 所属や役職等は掲載当時のものです

研究内容

転写・クロマチン・エピゲノムの分野で、新規に見出した変異株ライブラリを基に、新たな遺伝子発現制御メカニズムを探索しています。現在は、RNA polymerase IIのリン酸化修飾による転写活性制御とクロマチン状態の連動的な制御機構を研究しています。

実験内容・結果

Dynabeads M-280 Streptavidinを使用し、転写中のRNA polymerase II局在の高感度・高精度解析Precision Run-On sequencing(PRO-seq)を行いました。
PRO-seqでは、RNA polymerase IIが合成中の新生RNAの3’末端にビオチン化rNTPを1ヌクレオチド付加してRNA合成を停止させます。RNA 3’末端に相補的なDNA配列をRNA polymerase IIの位置とみなし、1ヌクレオチドレベルの高解像度で解析する技術です。他のゲノミクス解析と併用することで、転写状態（一時停止・伸長）や転写速度の推定を可能にする有用な技術です。
PRO-seqは微量の新生RNAを扱うこと、ライブラリ調製に多くのステップを要することから正確な実験操作と実験の効率化の両立が必要です.

I.Run-on反応

1. 細胞の培養

2. 回収

3. サルコシルによるnative chromatinの調製

4. Chromatin-bound RNA polymerase IIとビオチン化rNTPsを混合し、Run-on反応

5. ビオチン化新生RNA精製

II. ライブラリ調整

6. RNA断片化

7. Dynabeads M-280 Streptavidinによるビオチン化新生RNAの回収

8. RNA 3’アダプター付加

9. Dynabeads M-280 Streptavidinによるビオチン化RNAの回収

10. 5’ Cap除去と5’リン酸化

11. RNA 5’アダプター付加

12. Dynabeads M-280 Streptavidinによるビオチン化RNAの回収

13. 逆転写反応

14. ライブラリのPCR増幅とインデックス付加

15. SPRI磁気ビーズによるSize selection

III.シーケンシングとデータ解析

16. Novaseq X Plusによるシーケンシング(Paired End 150)

17. インフォマティクス解析

図１. PRO-seqの概要

図2. PRO-seqによるRNA polymerase II局在解析

Dynabeadsの活用事例

ライブラリ調製の過程で、Dynabeads M-280 Streptavidin を用いて、ビオチン化RNA精製を計3回行った。

1. ビオチン化RNAと平衡化済みDynabeads M-280 Streptavidin(50ul slurry相当)をローテーターで20分転倒混和する

2. Dynamag-2でDynabeadsを回収

3. High Salt Bufferで洗浄x2回

4. Binding Bufferで洗浄x2回

5. Low Salt Bufferで洗浄x2回

6. TrizoleでDynabeadsに結合したビオチン化RNAを水層に回収

7. エタノール沈殿

Dynabeadsを使用しての感想

正確な実験操作と実験の効率化の両方が必要なPRO-seqにはDynabeadsが必須だと感じている。
コスト削減を目的として低価格の他社磁気ビーズと比較した。Dynabeadsはマグネットへの吸着が速やかで、実験の操作性が優れていた。他社製品は吸着に非常に時間がかかり操作性が実用的でないと判断して、Dynabeadsを継続的に使用している。

今後の展望

少量の細胞からの解析感度向上を目指しています。
加えて、操作性向上のために実験の半自動化への対応を準備中です。

ご利用いただいた製品

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