ラーニングコーナー
2021/05/24
エンドトキシンの測定といえばCharles River社の「Endosafe® 」に決まり！
- 微生物・エンドトキシン測定
このサイトではCharles River社 エンドトキシン試験システムの概要や製品の使用手順、および皆様からよくいただくご質問をまとめています。ユーザーの皆様に役立つ情報を随時更新していきますので、日々の業務にぜひお役立てください！
※お知らせ(2021年5月24日)※
PTSカートリッジを使用する前の手順が一部変更されたため、添付文書も改訂されました。
詳しくはこちら
Endosafe nexgen-PTSの導入を検討されているお客さま向けに、評価・検証用としてデモ機の2週間無料貸出(※)しております。
詳細はこちら
Charles River社のエンドトキシン試験システム
エンドトキシンとは、グラム陰性菌の細胞壁を構成するリポ多糖類（LPS）です。血液中へのごく微量の混入で発熱を引き起こす生理活性物質のため、生体内に直接導入される医薬品や器具に対するエンドトキシンの残存は厳しく管理されています。
1964年にカブトガニの血球抽出物（Limulus amebocyte lysate; LAL）がエンドトキシンの存在下で凝集・凝固する現象が発見され、LAL試薬を用いたエンドトキシン試験法が開発されました。カブトガニから抽出したLALはリコンビナントのLALに比べてグラム陰性菌の属（あるいは種）間での凝集・凝固反応の差が少ないため、Charles River社のエンドトキシン試験システムではカブトガニから抽出したLALを使用しています。
Charles River社のエンドトキシン試験システム（Endosafe®）はすべてUS FDAの認可を取得しています。さらに、日本薬局方収載のエンドトキシン試験に適合した製品や、約15分で測定可能な迅速試験システムなど幅広いエンドトキシン測定法に対応していますので、ご要望に合わせて最適な製品をご選択ください。
製品紹介（LAL試薬）
LAL試薬
Charles River社 のゲル化法、比濁法および比色法各製品は、日本薬局方に収載されているエンドトキシン試験法に適用可能な製品です。
US FDAの認可も取得しています。下記の表をご参考にしていただき、検出したいエンドトキシン濃度やサンプルに合わせてお選びください。
比濁法
ライセート試薬のゲル化に伴う濁度の変化を測定することにより、被験試料中のエンドトキシン濃度を測定する方法です。濁度は吸光度または透過率で示されます。高感度測定（0.005EU/mL）に対応した製品もございます。
LAL（比濁法/ゲル化法)マルチタイプ各種（比濁法/ゲル化法の両方に使用できます）
LAL（高感度比濁法）各種
比色法
エンドトキシンとライセート試薬との反応により発色合成基質から遊離される発色基の量を、吸光度または透過率で測定することでエンドトキシンを定量する方法です。発色基の量は吸光度または透過率で示されます。比色法はカイネティック比色法とエンドポイント比色法に分けられます。
・カイネティック比色法
エンドトキシン濃度と反応液が、あらかじめ設定された吸光度または透過率に達するまでに要する時間または発色の経時変化率との間の容量反応関係に基づく方法です。
Endochrome-K（比色法LAL試薬キット）各種
・エンドポイント比色法
エンドトキシン濃度と一定反応時間後における発色基の遊離量との間の用量反応関係に基づく反応です。
比色エンドポイント法LAL試薬キット
ゲル化法
エンドトキシンの存在によるライセート試薬の凝固反応に基づいて、エンドトキシンを検出する方法です。ゲル化試薬を入れた試験管を37℃・60分間インキュベートしてゲル化を判定します。ゲルが崩れなければ陽性、ゲルが形成されなければ陰性と判断します。
LAL（ゲル化法）マルチタイプ各種
LALシングルテスト（ゲル化法）各種
LAL（比濁法/ゲル化法)マルチタイプ各種（比濁法/ゲル化法の両方に使用できます）
製品紹介（迅速測定装置：Endosafe® nexgen-PTS™）
Endosafe® nexgen-PTS™は、最短15分でエンドトキシンの検出が可能な迅速試験システムです。必要な試薬（LAL試薬、合成発色基質、エンドトキシン標準品）がすべて専用カートリッジに封入されており、簡単かつ短時間でエンドトキシン試験を行うことが可能です。本システムはUS FDAの認可済み（2006年7月認可取得）であり、現在の規制ガイドラインの国際調和に準拠しています。
Endosafe® nexgen-PTS™システムの特徴
- 1サンプルの測定が最短15分
- 試験毎の検量線の作成が不要（保存検量線を採用）
- 測定に必要なサンプル量は100μL
- US FDA認可取得（2006年7月）
- 21CFR Part11対応
紹介動画：Endosafe® nexgen-PTS™システム
測定原理
Endosafe® nexgen-PTS™システムはリーダー（測定部）とカートリッジ（サンプル添加部）で構成されており、各サンプルの発色強度が閾値に達するまでの時間を計測するカイネティック-比色法に基づいて設計されています。
カートリッジには4本のラインがあり、その全てに発色基質とLAL試薬が封入されています。また、4本中2本のラインにはエンドトキシン標準品が封入されており、添加回収率を計算するためのスパイクライン（positive product controls）として使用します。保存検量線を採用しているため、試験毎に検量線を作成する必要はありません。
PTSカートリッジ 模式図
測定の流れ（約4分）
Endosafe® nexgen-PTS™システム、関連試薬に関してはCharles River社ウェブサイト、製品カタログにてご確認ください。
よくあるご質問
一般編
Endosafe製品は日本薬局方に収載されているエンドトキシン試験法に準拠していますか？
下記Endosafe製品は日本薬局方エンドトキシン試験法に準拠しております。試験の際には、日本薬局方エンドトキシン標準品（一次標準品）をお使いください。
【ゲル化法】
・LAL（ゲル化法）マルチタイプ各種
・LALシングルテスト（ゲル化法）各種
【ゲル化法/比濁法】
・LAL（比濁法/ゲル化法)マルチタイプ各種
【比濁法】
・LAL（高感度比濁法）各種
【比色法】
・Endochrome-K（比色法LAL試薬キット）各種
・比色エンドポイント法LAL試薬キット
Endosafe nexgen-PTSは、日本薬局方エンドトキシン試験法には準拠しておりません。
Endosafe nexgen-PTSは再生医療分野に使用可能ですか？
再生医療の分野では、最終製品のエンドトキシン試験に使用することが可能です。厚生労働省の「ヒト（自己）由来細胞・組織加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針に係るQ&Aについて」においては、エンドトキシン試験の手法は日本薬局方収載の試験方法を「参考」にするように述べられています。
参考：https://www.pmda.go.jp/files/000205397.pdf
リコンビナントLAL製品は扱っていますか？
いいえ、扱っておりません。エンドトキシン標準品やエンドトキシンが付着した器具等はどのように廃棄すればよいでしょうか？
エンドトキシンは環境中に広く存在する物質であり、毒物や劇物等には分類されないため、廃棄時に特別な処理を行う必要はありません。各施設や自治体のルールに従って廃棄してください。もし精製エンドトキシンを机や床にこぼしてしまった場合は、水でふき取っていただければ問題ありません。使用する試薬感度の選択方法を教えてください。
検出したいエンドトキシン濃度と、試験に用いるサンプルの希釈倍率から決定してください。サンプルの希釈倍率が高い場合には、検出可能な（希釈前サンプルにおける）エンドトキシン濃度が高くなってしまうことにご注意ください。
RSE（Reference Standard Endotoxin）とCSE（Control Standard Endotoxin）との違いを教えてください。
RSEは薬局方標準品として定められているエンドトキシン標準品のことを指します。CSEは二次標準品とも呼ばれ、薬局方標準品を基準として各ライセート試薬製造メーカーが力価を測定したエンドトキシンのことを指します。
日本薬局方に準拠したエンドトキシン試験を行う場合には、原則として日本薬局方エンドトキシン標準品を使用する必要があります。
比濁法と比色法はどのように使い分ければよいでしょうか？
比濁法では濁度変化を測定します。そのため、濁りが大きいサンプルには適用できません。一方、比色法では黄色発色の吸光度変化を測定します。そのため、405 nm付近に吸収波長を示すサンプルには適用できません。
サンプルのpHはどのように調整すればよいでしょうか？
ライセート試薬の至適pHは6-8です。サンプルのpHがこの範囲を外れる場合にはTrisバッファー等で希釈し、pHの調整を行ってください。Charles river社では下記濃度のTrisバッファーをご用意しております。サンプルのpHに合わせてお選びください。
・LAL試験用0.05M Trisバッファー（pH 9.0）
・LAL試験用0.1M Trisバッファー（pH 7.4）
・LAL試験用0.25M Trisバッファー（pH 9.0）
LAL試験用各種Trisバッファーの製品情報はこちら
希釈できないサンプルの場合はNaOHやHCl溶液を加えて調整してください。
希釈条件がどうしてもうまく決定できません。どうしたらよいでしょうか？
反応干渉因子試験に関するサポートも承っております。お気軽に弊社までお問い合わせください。RSE（Reference Standard Endotoxin）とCSE（Control Standard Endotoxin）の構造や使用されている添加剤に違いはありますか？
●E. coliのO抗原の違いCharles River社より販売されているCSEはE. coli O55:B5株由来のLPSを用いて製造されています。
一方、RSEはE. coli O113株を使用して製造されています。
●添加剤の違い
Charles River社のCSEには添加剤としてsucroseとPEG8000、RSEではLactoseとPEG8000が使用されています。
Endosafe nexgen-PTS装置編
Endosafe nexgen-PTSの透過光の波長を教えてください。
394±2nmです。透過光の光源を教えてください。
LED抗原を用いています。装置にUVを照射しても良いですか？
はい。問題ございません。装置のプラスチック部分が多少変色する可能性がありますが、性能には影響いたしません。メンテナンスや校正は必要ですか？
年に一度、温度キャリブレーションの実施を推奨しております。温度キャリブレーションのお申し込みにつきましては、ご利用の販売代理店様へお問い合わせください。
装置の不具合や故障につきましては随時対応させていただきますので、弊社までお問い合わせください。
解析中に装置を持ち運んでも大丈夫ですか？
Endosafe nexgen-PTSは装置に内蔵されたポンプによりサンプルを吸引し、カートリッジに封入された各試薬と攪拌しています。解析中に装置を動かしたり大きな振動を与えると正常な動作が行えなくなる可能性があるため、解析中の持ち運びは避けてください。
満充電までにどのくらいの時間がかかりますか？
約4~5時間かかります。満充電後の稼働時間を教えてください。
約3~5時間使用可能です。異なるロットのキャリブレーションコードを入力して、そのまま試験を行ってしまいました。得られた値をそのまま使用することはできますか？
ロット毎に割り当てられているキャリブレーションコードには保存検量線の情報が組み込まれています。別のロットのキャリブレーションコードを使用すると正しい測定結果が得られませんので、正しいキャリブレーションコードを用いて再測定を行ってください。なお、測定終了後にキャリブレーションコードを修正することはできません。詳しくは弊社までご相談ください。
装置の動作環境の仕様を教えてください。
動作環境の仕様は以下の通りです。温度：15~27℃
湿度：10~85%
Endosafe nexgen-MCS装置編
Endosafe nexgen-MCSで一度に測定できるカートリッジの枚数を教えてください。
5枚です。Endosafe nexgen-MCSでの測定時、タイムコースのグラフは表示されますか？
いいえ。タイムコースのグラフは表示されません。試薬編
比色法試薬の色素の測定に用いる波長を教えてください。
405 nm周辺（合成基質から遊離するp-ニトロアニリンの吸収波長）です。エンドトキシン特異的バッファー(CES-BG200)とはどのような試薬ですか？
通常、ライセート試薬はエンドトキシンだけでなく、真菌の細胞壁を構成する成分であるβグルカンにも反応します。本試薬をサンプルの希釈液に添加することでライセート試薬によるβグルカンへの反応を抑制し、エンドトキシン特異的な試験を実施することが可能です。エンドトキシン特異的バッファー(CES-BG200)の使い方を教えてください。
エンドトキシン特異的バッファーとエンドトキシン試験用水を1:1の割合で混合し、サンプル希釈用のバッファーとしてご使用ください。エンドトキシン特異的バッファー（CES-BG200）の原理を教えてください。
エンドトキシン特異的バッファーには大過剰のβグルカンが含まれています。大過剰のβグルカンはそれ自身によってβグルカンによるLALの活性化を抑制することが知られており、本試薬もこの仕組みを利用しています。JPタイプのカートリッジに封入されているエンドトキシン標準品はどこから入手されていますか？
Charles River社において一般財団法人 医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団より製造頒布されているものを購入し、製造に使用しています。PTSカートリッジFDAとPTSカートリッジJPの違いを教えてください。
PTSカートリッジFDAにはCSE(Control Standard Endotoxin)が封入されています。このCSEは、米国薬局方エンドトキシン標準品を基準としてCharles River社において力価を測定したエンドトキシンです。PTSカートリッジJPには日本薬局方エンドトキシン標準品が封入されています。条件検討用カートリッジとはどのような時に使いますか？
サンプルの濃度による反応干渉の有無を検討する時に使用します。このカートリッジにはすべてのレーンにCSEが封入されています。最大4つの異なる濃度のサンプルにおいて一度に添加回収率を測定でき、反応干渉の有無を確認することができます。Endotoxin Indicatorsとはどのような製品でしょうか？
乾熱滅菌によるエンドトキシン不活化のバリデーションやモニタリングに使用するための製品です。Endotoxin Indicatorsの製品情報はこちら
Endotoxin Indicatorsの使い方を教えてください。
エンドトキシン不活化処理無し、処理済みのバイアル内のエンドトキシン値を、比濁法や比色法により検出・比較し、エンドトキシン不活化の程度を確認します。 この時、ポジティブコントロールの添加回収率が50 - 200%の範囲内であることをご確認ください。Endotoxin Indicatorsの感度はどのように選択すればよいですか？
お使いのLAL試薬の表示感度に合わせてご選択ください。Bio-dispersing試薬とは何ですか？
比濁法によるヒト血清アルブミンの測定用に開発された試薬であり、タンパク濃度の濃いヒト血清アルブミンサンプルにおいて、反応干渉作用を緩和するために使用します。他の試験方法（ゲル化法、比色法）で使用したい場合には、本試薬による反応干渉作用が起こらないことをあらかじめご確認ください。各試薬の有効期限を教えてください。
| 製品名 | 有効期限 |
| カートリッジ各種 | 製造後2年 |
| LAL試験用水（LAL reagent water） | 製造後3年 |
| Bio-dispersing試薬 | 製造後2年 |
| Trisバッファー各種 | 製造後2年 |
| エンドトキシン特異的バッファー | |
| Endotoxin Indicators各種 | 製造後2年 |
| ※未開封の場合 |
Endotoxin Indicatorsのバリデーション方法の例や不活化時間について教えてください。
charles river社から販売されているEndotoxin IndicatorsにはE. coli O55:B5株由来のエンドトキシンが使用されています。また、添加剤は含まれていないということが公表されています。エンドトキシン不活化の条件設定につきましては上記の情報や過去の文献等を参考にしてご検討ください。参考文献：
●Destruction of typical endotoxins by dry heat as determined using LAL assay and pyrogen assay (1993)
●Studies on the thermal destruction of Escherichia coli endotoxin
Endotoxin Indicatorsの製品情報はこちら
手法編
Endosafe nexgen-PTSで使用される保存検量線はどのように作成されていますか？
まずRSE（Reguratory Standard Endotoxin）10000 EU/vialを5 mLのLAL試験用水に溶解し、2000 EU/mLの溶液を調整します。そこからさらに希釈系列を調整し、それぞれの濃度の溶液における透過光の減少率が閾値に達するまでの反応時間を測定することで保存検量線を作成しています。例えば感度0.01~1.0 EU/mLのカートリッジの場合、1 EU/mL、0.1 EU/mL、0.0 1EU/mLの溶液を調整し、反応時間を測定しています。なお、CoAには各濃度の溶液における反応時間が書かれています。脂質を多く含むサンプルの調整方法を教えてください。
下記いずれかの方法で測定することができます。①サンプルを油相と水相に分離して測定する方法脂質を含むサンプルとエンドトキシン試験用水を等量ずつ混和し、37℃で加温します。その後よくボルテックスし、油相と水相に分かれましたら水相のみを取り出して測定してください。
②脂質をエンドトキシン試験用水に可溶化して測定する方法
エンドトキシン試験用水にDMSOを加え、脂質をエンドトキシン試験用水に可溶化します。可溶化したサンプルは反応干渉が起こらない濃度まで希釈し、測定してください。この方法の場合、高濃度のDMSOは反応干渉を引き起こすためサンプルを大幅に希釈しなければならない可能性があります。
詳細なご質問につきましては、弊社までお問い合わせください。
BSA溶液の解析方法を教えてください。
BSA溶液は熱処理を行ったのち、反応干渉の起こらない濃度まで希釈して測定してください。細胞懸濁液の解析方法を教えてください。
下記いずれの方法においても測定が可能です。①細胞懸濁液をバッファーで希釈して測定
②細胞懸濁液を遠心分離して上清を測定
③細胞懸濁液を溶解して測定
詳細なご質問につきましては、弊社までお問い合わせください。
なぜ細胞培養液や培養上清のエンドトキシン試験ではエンドトキシン特異的バッファー（CES-BG200）を使用することが多いのですか？
βグルカンによる反応干渉を抑制するために、エンドトキシン特異的バッファーがよく使用されています。 細胞培養液や培養上清にはβグルカンが含まれていることがあり、その由来は様々です。例えばセルロース製のメンブレンフィルター、糖、微生物菌体、微生物由来の発酵産物などが挙げられます。その中でも特にセルロースが、βグルカンのコンタミネーションの主な原因となることが多いようです。参考文献：
●(1→3)-β-D-Glucan: Pharmaceutical Contaminant and Biological Response Modifier (2016)
●Pharmaceutical Product Impurities: Considering Beta Glucans (2013)
エンドトキシン特異的バッファーの製品情報はこちら
解析編
Endosafe nexgen-PTSからタイムコースのグラフをデータ出力することは可能ですか？
いいえ。出力することができません。テストレポートのみ、PDF形式で出力することが可能です。Endosafe nexgen-PTSからのデータ出力に使用できるUSBの種類を教えてください
USB type AまたはUSB type Bが使用できます。USBは、FAT32でフォーマットされたものをご用意ください。なお、Mini USBとUSB type Cは使用できませんのでご注意ください。検量線の範囲内の時間いっぱいまで測定が行われず、途中で終了してしまいました。なぜでしょうか？
Endosafe nexgen-PTSはカイネティック比色法に基づいて設計されており、各サンプルの発色強度が閾値に達するまでの時間（秒）からエンドトキシン値を算出しています。したがってサンプルに混入しているエンドトキシンが多ければ多いほど閾値に達するまでの時間が短くなり、その時点で測定が終了します。測定結果のレポートに表示される「Spike value」とは何ですか？
Spike valueとは、スパイクレーン（レーン2, 4）で検出されたエンドトキシン量からサンプルレーン（レーン1, 3）で検出されたエンドトキシン量を引いた値です。つまり、Spike valueは元々カートリッジに添加されているエンドトキシンの検出量を示しています。このSpike valueの値を基にして添加回収率（Spike recovery）が算出されています。
製品資料・マニュアル・CoA
製品資料・マニュアル
- Charles River社エンドトキシン試験システム 製品カタログ
- Endosafe nexgen-PTS簡易マニュアル（Ver. 10以前）
- Endosafe nexgen-PTS簡易マニュアル（Ver. 11以降）
CoA
- こちらのサイトより、Endosafe®製品のCoAを入手できます。
Charles River社 Microbial Solutions Customer Portal
※Charles River社のサイトへ遷移します（英語）。 - CoAの検索方法
上記サイトへ遷移後、左下の「Enter Lot Number Here」にロット番号をご入力ください。
Topics - Low Endotoxin Recovery (LER) 解説記事
弊社取り扱いのEndosafe製品のメーカーでもありますCharles River Laboratories社微生物研究部門の土谷正和先生に、欧米で話題となっているLow Endotoxin Recovery（LER）について解説いただきました。
また、ご希望の方には記事の基となっている土谷先生の日本語総説の別刷りをお送りいたします。
是非、下記リンクからご覧ください。
