FAQ
- 用途別細胞培養
- CloneRで処理するシングルセルをソーティングするための、FACSプロトコールはありますか？
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STEMCELL Technologies社では、FACSによるソーティングのプロトコールを作成中です。下記は参考プロトコールです。
1． Vitronectin XFでコーティングしたnon-TCプレートを用意（室温で2-3時間プレコート）
2． 液層を除去後、CloneRを添加した100 uLの培地を加え、ソーティングの1時間前にインキュベーターに設置し適切な温度・湿度にしておく
3． ウェルから培地を除去
4． 細胞にシングルセル解離試薬（ACCUTASE、TrypLEなど）を加え、4-6分間インキュベーション
5． P1000または同様のピペットでコロニーに直接にかけるようにして細胞を剥離し、緩やかに3-4回ピペッティングして細胞塊を壊す
6． CloneRを添加した温かい培地に細胞懸濁液を添加（解離試薬：培地=1：3）
7． チューブをしっかりとはじいて混合し、細胞塊をバラバラにする（細胞数を数える）
8． 1200 rpm、5分間、細胞懸濁液を遠心する
9． 上清を除去し、2?3回チューブをしっかりはじいてペレットを壊す
10．CloneRを添加した培地を適量を加え、1 mLあたり1x10^6細胞に調製する
11. セルソーターの準備ができるまで細胞を氷上（暗所） に置く
12. 温めておいたプレートに直接にソートする
ソーティングのセットアップ
・ 装置： Aria Fusion
・ ノズルサイズ： 70 micron
・ ソートモード： single-cell
・ 分取速度： ＜5000 events/秒
・ マーカーでのソートデータ： なし
