製品の特長

PI3Kは細胞膜の構成成分であるイノシトールリン脂質をリン酸化するキナーゼです。PI3K/Aktシグナル伝達経路は細胞の代謝、成長、生存などに重要な経路です。

PI3Kの一部をコードするPIK3CA遺伝子の変異は、乳がんをはじめとする多くのがんで確認されています。また乳がんの治療薬であるPI3K阻害剤における反応性とも密接に関連しています。

本製品はADx-ARMS法によって、FFPEサンプルからPIK3CA遺伝子の5箇所の変異を検出する試薬です。

＜Amoy Diagnostics社Real-time PCR Assayシリーズの特長＞

• 簡便な操作：ワンステップの操作、解析まで含めわずか90分
• 高感度、高い正確性：1%の変異遺伝子まで検出可
• 高信頼性：内部標準も同時検出、ポジティブコントロールもキットに同梱
• 高品質の製品：国際基準ISO13485を取得し、GMPプラントにて製造、管理

＜ADx-ARMS法の原理＞

ADx-ARMS（Amplification Refractory Mutation System）法は、3'末端に変異特異的なプローブを使用し、高感度に変異遺伝子を検出する技術です。 チューブ内で、2ステップの増幅を行います。ステップ1で特異性の高い増幅を、ステップ2で効率良い増幅を行います。

＜本製品で検出可能な変異＞

PIK3CA遺伝子の下記5箇所の変異を検出します。

• H1047R（3140A>G)、H1047L（3140A>T)
• E542K (1624G>A)
• E545D (1635G>T)、E545K (1633G>A)

＜本製品の構成について＞

• PIK3CA Reaction Mix（5種）：変異遺伝子および内部標準を検出するプライマー、プローブ、dNTPs
• PIK3CA External Control Reaction Mix（1種）：DNA阻害物質の有無、DNA品質評価用のReaction Mix
• PIK3CA Enzyme Mix：Taq DNA Polymerase、Uracil-N-Glycosylase
• PIK3CA Positive Control：プラスミドDNA

＜実験ステップについて＞

① total DNA抽出：サンプルからDNAを抽出します。

※DNA抽出試薬は本製品に含まれておりません。

② DNA濃度調整：1.5-3 ng/µlとなるように1×TE buffer (pH 8.0)でDNA溶液を希釈します。

※推奨DNA濃度はFFPEサンプルの保存期間によって変わります。

③ PCR試薬の調製、分注：PIK3CA Enzyme Mixと5種のPIK3CA Reaction Mix、PIK3CA External Control Reaction Mixをそれぞれ混合し、PCRチューブに分注します。

④ サンプル分注：調整したDNAサンプルおよびネガティブコントロール（水）、キット付属のPIK3CA Positive Controlを各チューブに加えます。1サンプルあたり6チューブに分注します。

⑤ Real-time PCR：マニュアル記載の条件でReal-time PCRを行います。

⑥ 結果判別：増幅が認められた蛍光の種類と、Ct値を確認します。

＜結果例＞

FAM標識のPCR産物は変異箇所由来、HEX/VIC標識のPCR産物は内部標準由来となります。

ネガティブコントロール・Positive Control・各サンプルのHEX/VIC標識（内部標準由来）のPCR増幅結果から、実験が妥当であるかを判断します。

次にマニュアル記載の基準に基づき、各チューブのFAM標識の増幅産物のCt値より、変異陽性か陰性かを判定します。

＜対応するReal-time PCR機器について＞

下記の機器で検証済です。機器によってアダプターが必要になる場合があります。機器により製品コードが異なりますので、お問い合わせください。

• Stratagene：Mx3000P
• ThermoFisher Scientific：ABI 7500
• Roche：LightCycler480
• Bio-Rad：CFX96
• Qiagen：Rotor-Gene Q/6000

＜Real-time PCR Assayシリーズで検出可能な変異遺伝子＞

がんのシグナル経路に関わる下記遺伝子が検出可能です。 各遺伝子の検出に対応するキットをご利用ください。