FAQ
- 用途別細胞培養
- NeuroCult NCFC Assay kit(ﾏｳｽ)の後継品と代替プロトコールについて教えてください。
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Neurocult NCFC Assay Kit(ﾏｳｽ)（商品コード：ST-05740）は、販売終了となり、代替品もない状況となっております。
従来のNeurosphere assayに関しまして、下記の引用文献をもとに培地を調整してお使いください。- Natalie D Bull et al. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell.J Neurosci 25 (47) 10815-10821 (November 23, 2005).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6725873/
- Louis SA et.al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 2008 Apr;26(4):988-96 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18218818/
*Neurosphereのクローン解析*
もしも次の世代のneurosphereを形成する細胞が現在のneurosphere中に何個あるかクローン解析をおこないたい場合には、次のプロトコールが有効です。このプロトコールは基本的にはlimiting dilutionであり、96 well plateのウェルにシングルセルまたはできるだけ少数の細胞を播種して次の世代のneurosphere形成をチェックするものになります。1. 下記、NeuroCult™ manualに従ってneurosphereを培養します。
<https://cdn.stemcell.com/media/files/manual/MA28704-In_Vitro_Proliferation_Differentiation_Mouse_Neural_Stem_Cells_Progenitor_Cells_Using_NeuroCult.pdf?_ga=2.182479523.460070129.1502726704-1010860702.1483484616>
2. 培養7-8日後、培地と細胞を適当な滅菌済み細胞培養チューブに回収します。もしも培養器に細胞が付着して残っている場合には、培地の水流を当てるなどして細胞を剥がして回収します。回収したら、チューブを400 rpmで5分間遠心します。
3. EGFが含まれている上清をピペットで除去します。
4. Neurosphereを5- 10 mLのcomplete NeuroCult™ NSC Proliferation Medium (EGF 20 ng/mL入り)に再懸濁します。
5. 懸濁したneurosphere (3 - 5 mL)を60 mmディッシュ（またはneurosphere1個をディスポーザブルのプラスチックピペットチップで採取することができるような培養容器）に移します。
6.ピペットを200 uLにセットして、プラスチックピペットチップを使い1個のneurosphereを採取します。
7. 1個のneurosphereを500 uLエッペンドルフチューブ（予めcomplete NeuroCult™ NSC Proliferation Medium (+ 20 ng/mL EGF)を100 µL入れておいたもの）に移します。同じプラスチックチップを使い、40 – 50回ピペッティングしてneurosphereを粉砕します。
8. 細胞濃度がおよそ1 - 2 cells/10 µL（およそ1/100希釈）になるまで段階希釈をおこないます。
9. 予め200 µLのcomplete NeuroCult™ Neural Stem Cell Products NSC Proliferation Medium (+ 20 ng/mL EGF)を入れておいた96 well plate (推奨：Corning® 96 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Microplate with Lid (Item #3474))に10 uLの細胞液を添加します。
10. 24時間後、プレートのスコアリングをおこないます。
11.１つの生細胞が確認できるウェルをすべてマークし、それらのウェルについて9 - 10日後、次の世代のneurosphere形成について再度スコアリングをおこないます。*Alternative Protocol:*
1.細胞を、NeuroCult™ manual に従ってNeurosphere Assay conditionで培養します。
2. 培養7-8日後、培地と細胞を適当な滅菌済み細胞培養チューブに回収します。もしも培養器に細胞が付着して残っている場合には、培地の水流を当てるなどして細胞を剥がして回収します。回収したら、チューブを400 rpmで5分間遠心します。
3. EGFが含まれている上清をピペットで除去します。
4. Neurosphereを2 mLのcomplete NeuroCult™ Neural Stem Cell Products NSC Proliferation Mediumに再懸濁します。Neurosphereをファイア研磨したガラスピペットでピペッティングして物理的に乖離させます。ピペッティングは20回ほどおこない、細胞塊のないシングルセルの状態にします。もしも乖離していない組織が残っている場合には、1-2分静置し、（シングルセルが含まれている）上清部分を新しいチューブに回収します。 ご注意:ピペッティングはしっかりおこなう必要がありますが、細胞上清液が泡立たないようにしてください。
5.解離していない細胞にさらにcomplete NeuroCult™ Neural Stem Cell Products NSC Proliferation Mediumを添加し、トータル量が2 mLになるようにします。ピペッティングをしてシングルセルを含む上清をプールします。必要に応じてピペッティングを繰り返しおこないます。
6. 細胞を800 rpmで5分間遠心します。上清を除去して2 mLのcomplete NeuroCult™ Neural Stem Cell Products NSC Proliferation Mediumでピペッティングして再懸濁します。
7.シングルセル懸濁液を40 umのセルストレイナー（Catalog#27305)でフィルター処理をおこないます。
8.正確なボリュームを計測し、トリパンブルーで希釈（1/5または1/10希釈）して血球計算版を使って細胞数をカウントします。
9. 細胞濃度がおよそ1 - 2 cells/10 µLになるまで細胞懸濁液の段階希釈をおこないます。 10.予め200 µLのcomplete NeuroCult™ Neural Stem Cell Products NSC Proliferation Medium (+ 20 ng/mL EGF)を入れておいた96 well plateに10 uLの細胞液を添加します。
11. 24時間後、プレートのスコアリングをおこないます。
12.１つの生細胞が確認できるウェルをすべてマークし、それらのウェルについて9 - 10日後、次の世代のneurosphere形成について再度スコアリングをおこないます。
*Passaging Single Spheres（個々のneurosphere の継代）*
1. 96 well plateで形成された1個のneurosphereは、培養期間後も継代培養することが可能です。
2. Neurosphereは培養9 – 10後に細胞液を10 - 100 µl採り、complete NeuroCult™ Neural Stem Cell Products NSC Proliferation Medium (+ 20 ng/mL EGF)が入っているNunclon 35 mm tissue-culture dishに移すことにより解離させます。
3. 無菌の条件下で、neurosphereは500 uLエッペンドルフチューブ（予めcomplete NeuroCult™ Neural Stem Cell Products NSC Proliferation Medium (+ 20 ng/mL EGF)を200 µL入れておいたもの）に移します。ピペッティングを20 - 40回おこない、96 well plateに1 - 10 cells/10 µl (上記に同じ)となるように播種します。
4.１つのneurosphere から発生したneurosphere の数について、培養9 - 10日後にスコアリングをおこないます。
