FAQ
- タンパク・遺伝子発現解析
- Dynabeads His-tagの精製及びPull downプロトコールを教えてください。
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Dynabeads His-tagの日本語ワークフローについては下記のようになっております。
個々の手順についてのご説明は下記となります。
＜His-tagタンパク質精製プロトコール＞
His-tagタンパク質を含むサンプルは1 x Binding/Wash Buffer(*)でトータル700 μLにしておきます。
* 2 x Binding/Wash Bufferを2倍希釈することで調製します。
１．Dynabeadsをしっかりと懸濁します。（vortexで30秒、またはローテーターで5分）
２．50μL（2mg分）のDynabeadsをチューブに加え、マグネットに設置し2分放置します。
その後、上清を除去します。事前に用意した希釈サンプル700μLをチューブに加え、よく混合します。
３．室温で5分ローテーターで撹拌しながらインキュベートします。インキュベーション時間は10分まで延長可能です。
４．チューブをマグネットに置き、2分放置後、上清を捨てます。
５．300μLの1 x Binding/Wash Bufferを加え、しっかりと懸濁（vortexで30秒、またはローテーターで5分）、マグネットに置き、２分放置後、上清を捨てる（この操作を4回繰り返し、しっかりとWashします）。
６．タンパク質を溶出する場合は７．へ進みます。
・他のアプリケーションへ用いる場合、適量の1 x Pull-down Buffer（2 x を希釈し調製）をいれ、懸濁します。
・他のタンパク質のPull-downに用いる場合、Pull-downプロトコルの１．へ進みます。
７．100μLのHis-Elution Bufferを加え、室温で5分、ローラー撹拌でインキュベートします。
８．マグネットに置き2分後にHis-tagタンパク質を含む上清を新しいチューブへ移します。
＜Pull-downプロトコール＞
ビーズに結合しているHis-tagタンパク質を用いて別のタンパク質をPull-downしたい場合のプロトコルです。
１．サンプルを1 x Pull-down Bufferで調製します（最大トータル700μLまで）。
２．His-tagタンパク質精製プロトコルで作成したビーズ-His-tagタンパク質複合体に１．で用意したサンプルを加えます。
３．室温で10分～30分ローテーターでインキュベートします。
４．マグネットに置き２分後、上清を除去します。
５．300μLの1 x Binding/Wash Bufferを加え、しっかりと懸濁（vortexで30秒、またはローテーターで5分）、マグネットに置き、２分放置後、上清を捨てる（この操作を4回繰り返し、しっかりとWashします）。
６．50～100μLのHis-Elution Bufferを加え、室温で5分、ローラー撹拌でインキュベートします。
マグネットに置き2分後、His-tagタンパク質及び相互作用したタンパク質を含む上清を新しいチューブに回収します。
また、下記は固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーについての情報となります。
参考情報：Hisタグタンパク質の産生と精製（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/his-tagged-proteins-production-purification.html
