• CloneRが推奨している4日間より長く培地に含まれているとどうなりますか？

お勧めしません。細胞の形態が変化する可能性があります。まだこれらの形態が変化した細胞に関しての詳細はわかっていません。

• CRock inhibitorでは24時間添加した培地を使用する事になっています。CloneRが推奨している4日間より短い場合はどうなりますか？

STEMCELL Technologies社では、あいにくまだそのようなデータをもっていません。もし実施の際には推奨された4日間のプロトコールとも比較してください。クローニング効率およびコロニーサイズの影響を受ける可能性があります。

• 推奨された4日間の時間の長さは、最適化する（例：違う細胞株）必要がありますか？

STEMCELL Tehnologiesは、多数の細胞株を使って良い結果が出ています。それぞれの細胞株がそれぞれのクローニング効率ベースラインを有しますが、今までのテストした全ての細胞株は、CloneRがこのベースラインを上回るクローニング効率を大幅に向上させます。
A4：データを保有していません。

• 既にRock inhibitorを添加したナイーブ型iPSC培地は、CloneRも使えますか？

データを保有していません。

• プロトコールではCloneRはLaminin 521、MatrigelおよびVitronectin XFを組み合わせ使用できるようですが、一番良い基底膜はどちらが推奨ですか？

これまでの試験により、下記の事はわかっています。
・Laminin-521 (L521)のクローニング効率は、Vitronectin XF (VXF) and Matrigel (MG)より少々高い。
・mTeSR1 + CloneRは、どの基底膜で一番良い組み合わせ。
・VXFからのコロニー形態は、L521とMGのより良い。
・L521は、シングルセルdepositionによるクローンを生成する研究室に適している。
・コロニーはコンパクトでピックアップが簡単な低密度（＜25 cells/cm2）播種、クローンを生成する場合は、VXFとmTeSR1 + CloneRの組み合わせを推奨。
注意点：Vitronectin XFは、non-TC処理プレートで培養する事が重要です。STEMCELL TechnologiesではGreiner multi-well plates 又は、10cm suspension disを使用しています。Cell Adhere Dilution Bufferを用いてVitronectin XFを作ってください（Vitronectin XFのプロトコールより）。STEMCELL Technologiesでは、クローニングが開始する前に可能な限り長くコーティングのままで、プレートを保管します（実験のセットアップより、約１~４時間）。

• シングルセル継代し、懸濁培養をしたい場合は、mTeSR3DとCloneRを合わせて使用可能ですか？

CloneRはこのような目的に適していないで、推奨しません。

• CRISPRで使用するためにナイーブ型iPSCでCloneRをテストをしましたか？

STEMCELL Technologiesの経験ではCloneRは、ナイーブ型細胞のクローニング効率を大幅に増加させませんでした。

• CloneRは、細胞の生存率を改善するためにFACS中/後で使用可能ですか？

データはありませんが、CloneRはFACSでの細胞生存率を改善する可能性があります。CloneRを添加した培地での回収と再懸濁により、クローニング効率をアップさせると考えられます。１ウェルで複数の細胞をソーティングする場合は、CloneRが生存率を改善する可能性もあります。

• シングルセルをソーティングする用FACSプロトコールがありませんか？

STEMCELL Technologiesは、FACSプロトコールを作成中です。（2017年６月20日時点）
下記は、参考プロトコールになります。
1． Vitronectin XFでコーティングしたnon-TCプレートを使用（室温でコーティング2?3時間）
2． 基底膜を取り除いて、培地の良い温度・湿度を得るため、ソーティング前に100uLのCloneRを添加した培地を加えて、1時間インキュベーション
3． ウェルから培地を取り除く
4． 細胞にシングルセルの解離試薬（ACCUTASE/TrypLE）を加えて、4?6分インキュベーション
5． P1000 又は他のアスピレート用ピペットで、コロニーに直接にスプレーして細胞を解離し、細胞塊を破壊するため優しく3?4回上下にピペットする
6． CloneRを添加した暖かい培地に細胞懸濁液を加える（解離試薬：培地=1：3）
7． 細胞の混合および懸濁のため、チューブをしっかりと軽く叩く（細胞数を数える）
8． 1200rpm、5分で細胞懸濁液を遠心する
9． 培地を捨て、2-3回チューブをしっかりと軽く叩いてペレットを剥がして壊す 。1mL当たり1x10^6細胞を得るため、CloneRを添加した培地に適切なボリュームを加え、装置の準備ができるまで細胞を氷上（暗所）でキープ 保温プレートに直接にソートする

ソーティングのセットアップ： 装置：Aria Fusion ノズルサイズ：70 micronソートモード：シングルセル イベント：＜5000 events/秒 マーカーでのソートデータなし

• プロトコールで推奨されているMatrigelの希釈は1:100ですが、ロット特定ですか？

はい、希釈はMatrigelのロットに依存します。メーカーの推奨に従ってください。

• 完全な培地は、冷凍できますか？

テストした事がありません。冷凍できるかもしれませんが、必要ならばサプリメントを分注して冷凍することをお勧めします。

• GCDRを用いて、シングルセル細胞の懸濁を作る事が可能ですか？

いいえ。この場合は、GCDRが効率的ではないので、酵素消化を推奨します。

• 96ウェルを用いる場合の推奨はありますか？

96ウェルから培地を取り除いて、50 µL GCDRを加えて3?4分で、GCDRを取り除きます。次にコロニーを壊すために100 µL of mTeSR1 もしくは TeSR-E8をスプレーします。最後にvitronectin又はMatrigelをコーティングした24ウェルプレート（500 µL 培地を含む）に、コロニーを移します。

• mTeSR1およびTeSR-E8以外の培地( TeSR2又は他社製品)は、クローニング前の維持培地として、CloneRと組み合わせて使用可能ですか？

TeSR2は問題ないと考えますが、他社製品はデータを保有していません。

• CloneRは、フィーダー培養システムで使用可能ですか？

データはありません。

• プロトコールのセクションD、ステップ２のところで、なぜ培地交換の代わりに初期シード量の25％を加えますか？

培地交換できなくはないのですが、その必要はありません。細胞が非常に少ないので、培地の重要な成分を速く使い切っていないので、追加するだけで問題ありません。培地の節約にもなります。   Performance Data 

• CloneRは、ヌクレオフェクション後24時間経過したピューロマイシンセレクションにも対応しますか？これについての情報やデータありませんか？

実験に応じて異なります。もしクローニング前に細胞を回復させる（例：CloneRで高密度に細胞を播種する事）場合は、24時間経過後なら問題ないと思います。編集は、トランスフェクション後第１または第２分裂に発生するので、24時間だと陽性トランスフェクタントになる細胞を失う可能性があります。48時間以上が良いと考えます。 トランスフェクションからCloneRに直接にプレーティングする場合は、細胞が敏感なので、トランスフェクション後、３-４日以上回復するのは強くお勧めです。

• 製品ページの図２について、ROCKiはどのくらい時間使用していますか？

ROCKiは、ROCKiなしの培地に切り替える前にコントロールとして4日間を使用しています。

• シングルセル懸濁液の調整に関して、その後酵素が細胞に影響しないかの確認をしていますか？

データはありません。ACCUTASE / TrypLEなどどのようなシングルセル懸濁液調整試薬でも利用可能です。