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簡易プロトコル紹介: Dynabeads Protein A / Protein G を用いた免疫沈降(直接法)

[ 2017-09-11 ]

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Dynabeads Protein A / Gは、粒径2.8 µmの均一なビーズ表面に組換え体 Protein A あるいは Protein G を共有結合で固相化した磁性ビーズです。
高純度・低バックグラウンドな免疫沈降をわずか40分で行えます!

本稿では、直接法による免疫沈降の日本語簡易プロトコルを紹介いたします。

 

* ご案内 *

このプロトコルは、一般的な免疫沈降に対するものです。
各々の抗体とターゲットのために最適化が必要とされるかもしれません。
ここでは例としてDynabeads Protein A / Gを50 μL用います
これは必要に応じてスケールアップあるいはダウンが可能です。

 

 

INDEX

 

用意するBuffer類

サンプル調製

Dynabeadsの準備

抗体の結合

抗原の免疫沈降

標的抗原の溶出

関連情報

 

 

 

用意するBuffer類 

  • Cell lysis buffer 例)Cell Extraction Buffer、NP40 Cell Lysis Buffer
  • PBS, pH7.4 with 0.02% Tween 20
  • PBS, pH7.4(Washing Buffer)
  • 50 mM Glycine, pH 2.8(Elution Buffer:非変性)
  • NuPAGETM LDS Sample Buffer and NuPAGE Sample Reducing Agent (Elution Buffer:変性)

 

 

 

 

サンプル調製

細胞溶解には、用いるサンプルに適したものを用いてください。

推奨品:

  • Cell Extraction Buffer(Thermo Fisher Scientific: #FNN0011)
  • NP40 Cell Lysis Buffer(Thermo Fisher Scientific: #FNN0021)

 

 

 

 

Dynabeads Protein A / Gの準備 

1) ピペッティングまたは、ローラーにて回転させ(5 分)、完全にDynabeads Protein A / G(以下、Dynabeads)を再懸濁する
2) チューブへ Dynabeads 50 μL を移し、磁石(DynaMag)に取り付け、上清を除去する
3) 磁石からチューブを外し、抗体結合ステップへ進む

 

 

 

 

抗体の結合 

4) 使用する抗体(通常1 - 10 μg)をTween 20を含むPBS 200 μLで希釈し、3.のチューブへ加える(最適量は使用する各々の抗体に依存する)
5) 室温、回転下で 10 分間インキュベートする
6) チューブを磁石に取り付け、上清を除去する
7) チューブを磁石から外し、Tween 20を含むPBS 200 μL に再懸濁させ、優しくピペッティングすることでDynabeads - 抗体複合体を洗浄する
8) 免疫沈降ステップへ進む

 

クロスリンク

抗体の溶出を避けたい場合には、Dynabeadsと抗体をクロスリンクすることをご検討ください。

参考:クロスリンクの手順はこちら>>

 

 


 

抗原の免疫沈降 

9) チューブを磁石に取り付け、上清を除去する
10) Dynabeads - 抗体複合体に抗原を含むサンプル(通常 100 - 1000 μL)を加え、 ピペッティングにより静かに再懸濁する
11)

室温、回転下で10分間インキュベートする

Note: インキュベーション時間は、標的タンパク質の濃度及び、抗体の濃度が高い時、短いインキュベーション時間で(10 分)、十分にターゲットが捕捉可能です。必要に応じて、インキュベーションは 1 時間まで延長できます

12) チューブを磁石に取り付け、上清を除去する。必要であれば、上清は新しいチューブへを移しておく
13) 200 μLのPBSで3回Dynabeads - 抗体抗原複合体を洗浄する
14) 100 μLのPBSで Dynabeads - 抗体抗原複合体を再懸濁し、チューブの壁面についたタンパク質のコンタミを防ぐため、新しいチューブへ Dynabeads - 抗体抗原複合体を含む懸濁液を移す
15) 「標的抗原の溶出」ステップへ進む

 

 


標的抗原の溶出 

(A: 変性、B: 非変性 いずれかの条件で溶出が可能)

 

A: 変性溶出 

16) 磁石にチューブを取り付け、上清を除去する
17)

20 μLのNuPAGE LDS Sample Buffer / NuPAGE Reducing Agent mix (いずれもThermo Fisher Scientific)を加え、優しくピペッティングでDynabeads - 抗体抗原複合体を再懸濁した後、70°Cで 10 分間インキュベートする

Note: SDSサンプルバッファー等、他のバッファーを用いることも可能です。ゲルにロードする前に、用いるバッファーの推奨する温度、時間でインキュベーションしてください

18)

チューブを磁石に取り付け、上清 / サンプルをゲルにロードする

 

B: 非変性溶出

19) (ステップ15より)磁石にチューブを取り付け、上清を除去する
20) 20 μL の Elution Buffer(50 mM Glycine pH 2.8)を加え、優しくピペッティングでDynabeads - 抗体抗原複合体を再懸濁したDynabeads - 抗原抗体複合体を静かに再懸濁する。この時、泡立たないように注意する
21) 室温で 2 分間インキュベートする
22)

チューブを磁石に取り付け、新しいチューブへ目的物を含む上清を移す。

もし得られたタンパクを機能的な分析に用いる、あるいは保存する必要がある場合は、溶出液のpHを1 mM Tris-HCl, pH7.5を用いて調整する

 

 

 

関連情報 

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製品リスト

商品コード

商品名

梱包単位

DB10001

Dynabeads Protein A

1 mL

DB10002

Dynabeads Protein A

5 mL

DB10003

Dynabeads Protein G

1 mL

DB10004

Dynabeads Protein G

5 mL

DB10006

Dynabeads Protein A Immunoprecipitation Kit

2 mL

DB10007

Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit

2 mL

DB10008

Dynabeads Protein A

50 mL

DB10009

Dynabeads Protein G

50 mL

 

 

関連リンク