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新技術!in situでタンパク質とRNA(single-molecule sensitivity)を同時検出

[ 2017-04-27 ]

これまで転写、翻訳および翻訳後修飾の間の複雑な相互作用は、RNAまたはタンパク質レベルどちらかを測定する典型的なエンドポイントアッセイについて、視界から隠されてきました。in situハイブリダイゼーション(ISH)は、個々の細胞における特異的RNA転写産物レベルを調べる方法を提供し、免疫細胞化学(ICC)は特定タンパク質(タンパク質修飾)の局在を可視化するために抗体が利用されます。一方、シングルセルにおけるRNA及びタンパク質の同時検出は、ICCおよびISHプロトコールの不一致によって阻まれてきました。さらに、従来ISH法では少量のRNA種を検出するための感度不足、複数項目の検出に制約があり解析を複雑にしてきました。

 

InvitrogenTM ViewRNATM Cell PlusアッセイはICCとViewRNA技術…蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)の原理とbranched-DNA(bDNA)によるシグナル増幅技術…を用い、シングルセルレベルでタンパク質とRNA(single-molecule sensitivity)を同時に検出します。本アッセイは、indirect/direct ICCの両方を使用し、各細胞サブセットの詳細な特徴づける細胞表面及び細胞内タンパク質のイムノフェノタイピングと最大3 種類のRNAを同時検出することが可能です。シングルセルレベルでのタンパク質とRNAの可視化は、生物学の様々な分野で有用なツールです。


【アプリケーション例】 

  • サンプルの多様性の解析
  • 同一の細胞内におけるRNA とタンパク質発現レベルの相互関係の解析
  • 各細胞サブセットにおけるmiRNA などのノンコーディングRNAの解析
  • 感染細胞におけるウィルスRNAの解析
  • 抗体の選択肢が限られた場合のmRNA による発現解析
  • ハイスループットな化合物スクリーニング

 

【サンプルの多様性の解析】

ラット海馬初代細胞のフェノタイピング

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図1. ラット海馬初代培養細胞(13日間培養)をニューロン(Anti-MAP2 eFluor 570, 赤色, cat. no.41-9763)及び、アストロサイト(Anti-GFAP Alexa488, 緑色, cat. no.53-9892)の抗体、Pvalb mRNAプローブ(Type 6, 青色, cat. no. VC6-15122)を使用しViewRNA Cell Plus Assayで染色した。Pvalbは神経のサブセットは検出された。核はDAPI(ピンク色)で染色した。
データ提供:Susanne tom Dieck & Erin Schuman, MPI Brain Research, Frankfurt/Main, Germany

 

【感染細胞におけるウィルスRNAの解析】 

ジカウイルスRNAおよびチューブリン画像

 

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図2. ジカウイルス(MR766m)-infected Vero細胞をAnti-alpha Tubulin Alexa Fluor 488 antibody(緑色, cat. no. 53-4502)及びジカウイルスRNA-specific probe set Type 1(赤色, cat. no. VF1-19981)を使用しViewRNA Cell Plus Assayで可視化した。核はDAPI(青色)で染色した。
データ提供:Brass laboratory, University of Massachusetts Medical School

 

【ノンコーディングRNAのシングルセル解析】 

ヒト乳がん細胞におけるマイクロRNA発現プロファイルの違い

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図3.  腺管及び腺癌の乳癌細胞株におけるViewRNA Cell Plus Assayを使用しtubulin、Ki-67、survivinタンパク質に沿ったマイクロRNA(miR)発現の検出。

左3列) miR-145, miR-34a, and miR-143 (白色, cat. nos. VM1-10252, VM1-10243, VM1-10251)は、異なる細胞株で同程度の発現を示した。miRはAnti-alpha Tubulin Alexa Fluor 488(緑色, cat. no. 53-4502)と共染色した。核はDAPI(青色)で染色した。
中3列) Let-7a, miR-19a(白色, cat. nos. VM1-10409, VM1-10350)は、各乳癌細胞株で高発現を示した。miR-221(白色, cat. no. VM1-10264)は、非常に低い発現を示し、MDA-MB-231細胞で他の細胞株よりわずかに高い発現を示した。miRはAnti-Ki-67 eFluor 660 (赤色, cat. no. 50-5699)と共染色した。核はDAPI(青色)で染色した。
右3列) miR-17(白色, cat. no. VM1-10233)は、各乳癌細胞株で高発現を示し、SKBR3細胞で他の細胞株よりわずかに低い発現を示した。miR-30d, miR-107(白色, cat. no. VM1-10241, VM1-10246)は低い発現を示した。miRはAnti-Survivin Alexa Fluor 488(緑色, cat. no. 53-9176) と共染色した。 核はDAPI(青色)で染色した。


ViewRNA Cell Plusアッセイ 追加データはこちら>> 

 

【他のbranched DNAを使用したアプリケーション】 

QuantiGene Plex Assay

LuminexのxMAP テクノロジーを用いて、96 well plateの1 well当たり3-80遺伝子を同時にライセートサンプルから直接測定が可能です。

PrimeFlow RNA Assay

フローサイトメトリーで何百万個もの各シングルセル中でRNA及びタンパク質の発現を同時に検出します。アッセイは、標準的なフローサイトメーターを使用し、最大4つのRNAの同時検出が可能です。RNA の検出を、細胞内タンパク質や細胞表面抗原の抗体による染色と組み合わせることにより、シングルセルレベルでの細胞内動態の解析に新しいビジョンが広がります。

ViewRNA ISH Cell Assay

標準的な蛍光顕微鏡またはハイコンテントイメージャーを用いて、single-molecule sensitivityで最大4つのRNAの同時検出が可能です。96-well又は及び384-wellのハイコンテントバージョンでは、標準的な自動化システムと適合し、創薬開発で使用可能な強力なプラットフォームを提供します。

ViewRNA Tissue Assay

組織微小環境中で最大2つのRNAを可視化することが可能です。ViewRNA Tissue Assayは、RNA ISHに高感度化及び簡便さを提供し、他のテクノロジーでは検出できなかったターゲット遺伝子の可視化が可能です。

 

【技術資料】

ViewRNA Cell Plus Assay製品パンフレット(英語)

 

【製品リスト】

商品コード

商品名

梱包単位

TFA-88-19000-99

ViewRNA Cell Plus Assay Kit

1 kit

TFA-88-19002-11

ViewRNA Cell Plus Cytospin Module Kit

1 kit