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ヒトES/iPS細胞から長期培養可能な ”ミニ腸” オルガノイドを効率的に!

[ 2018-08-29 ]

ヒト多能性幹細胞(ヒトES/iPS細胞、hPSCs)は、疾患モデル、ドラッグスクリーニングおよび再生医療に対して非常に重要なツールです。最近の研究によりヒトES/iPS細胞は、発達においてシグナル伝達経路を模倣することで、組織特異的細胞へ分化できることが示されています。分化の特定段階における成長因子のタイミング、持続時間と濃度が、細胞運命と細胞系列へ分化決定の重要な要因です。

ヒトES/iPS細胞からヒト腸管オルガノイド(Human Intestinal Organoids:HIOs)への分化・形成を標準化するために、STEMCELL Technologies社は、Jason Spenceら(Spence et al., Nature. 2011 Feb 3;470(7332):105-9)のin vitroでHIOsへ分化・形成するプロトコールに改良を加え、STEMdiff Intestinal Organoid Kit(製品コード:ST-05140)を開発しました。

STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、ヒトES/iPS細胞から3段階(1. 胚体内胚葉、2. 中/後腸、3. 小腸)(Fig. 1)への分化を促進する、効率的で再現性が高い無血清培養系です。

 

Fig. 1 ヒトの腸の発達と内胚葉の器官形成

STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、未分化ヒトES/iPS細胞の中内胚葉の重要な段階を経て、効率的に胚体内胚葉へ誘導・形成し、さらに中胚葉および後腸前駆細胞を生じる後方内胚葉を形成します。これらの前駆細胞は、重要な転写因子Caudal Type Homeobox Protein 2(CDX2)を発現し、さらに分化すると小腸細胞に成熟します。

 

 

Fig. 2 STEMdiff Intestinal Organoid Kitのプロトコールおよび分化段階における形態変化

STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、30日間以内でヒト腸管オルガノイドを形成が可能な効率性で再現性が高い無血清培地。他のプロトコールと比較して、ヒトES/iPS細胞株を問わずHIOsの形成を促進することが可能。ヒトES/iPS細胞由来HIOsは、STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium(商品コード:ST-05145)を用いて長期培養(>11 month, n=3)・増殖し、凍結保存が可能。

 

 

Fig. 3 2Dモノレイヤーの分化過程における形態変化 

(i)スフェロイド形成、出芽、(ii)回収、(iii)Corning®Matrigel®ドームに埋め込み、(iv)更にHIOsへ分化

 

 

データ

 

Fig. 4 STEMdiff Intestinal Organoid Kitは、効率的に中/後腸マーカー(CDX2)の発現を誘導

(A) 免疫染色解析(中/後腸マーカー:CDX2;上皮マーカー:E-カドヘリンおよび、間葉系細胞マーカー:ビメンチン)。(B)フローサイトメーターで分化した中/後腸モノレイヤーの定量分析。複数のES(H9、H7)・iPS(WLS-1C、STiPS-M001)細胞株における後方内胚葉マーカー(CDX2)発現の上昇および前方前腸マーカー(SOX2)が発現していない事を示す(mean±SD, n≥2)。 

 

 

Fig. 5 2Dモノレイヤーの中/後腸から効率的に3Dスフェロイドへの形成・出芽 

(A)8日目で浮遊後腸スフェロイドを有するモノレイヤーのイメージおよび(B) 4~11日目で分化したスフェロイドの定量分析(細胞株:STiPS-M001;mean±SD)。(C)出芽形成の例:WLS-1C細胞由来分化した8日目のオルガノイドイメージ(左:接着後腸スフェロイド;右:定量分析するために、懸濁液状態にしたスフェロイド)(D) テストされた4つの細胞株は、中/後腸スフェロイド形成する可能性を示す(ヒトES/iPS細胞株分化の内在的差による出芽の違いがある)。(E)リリースされた中/後腸スフェロイドの9日間後分化の免疫染色解析。スフェロイドの偏極上皮であるマーカー(CDX2、E-カドヘリン、EpCAM)および(F)間葉系細胞マーカー(ビメンチン、CDX2)を発現した。

 

 

Fig. 6 ヒトES/iPS細胞由来HIOsは素早く増殖し、腸・間葉系細胞の重要なマーカーを発現 

(A)ヒトES/iPS細胞由来HIOsは、出芽形成を伴う厚壁の偏極上皮構造の表現型および中央の中空な内腔を取り囲む薄壁上皮の嚢胞性のオルガノイド形態を示す。(B) STEMdiff Intestinal Organoid Growth Mediumで培養した複数のES(H9、H7)・iPS(WLS-1C、STiPS-M001)細胞株由来HIOsの増殖速度(mean±SD, n=3)。(C)28~110日間分化したHIOsは、腸管上皮・間葉系細胞の重要なマーカーを継続的に発現(qPCRデータ:mean±SD, n=1)。(D-G)H9 ES細胞から分化193日目の免疫染色解析。HIOsは、腸細胞・杯細胞・腸内分泌系特異マーカー(CDX2, MUC2, EpCAM, KRT20, GATA4, SOX9, CHGA)および間葉系細胞マーカー(デスミン、ビメンチン)を発現。Ki67の遺伝子発現により、細胞の多能性および推定腸管幹細胞の存在(オルガノイド長期培養の可能性)を確認できる。350日以上維持培養し、一か月間凍結保存したHIOsは性能を回復し(n = 3)、STEMdiff Intestinal Organoid Growth Mediumで培養可能。 

 

 

製品リスト

品コード

製品名

梱包単位

ST-05140

STEMdiff Intestinal Organoid Kit

Kit

ST-05145

STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium

Kit

 

 

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