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脳オルガノイド培養の確認すべきポイント「STEMdiff Cerebral Organoid」

[ 2018-06-25 ]

ヒト多能性幹細胞(hPSCs)由来 2次元(2D)神経培養系は、神経研究に有用なモデルですが、後生動物(metazoan, 多細胞動物)脳の複雑な組織化構造を再現するには、限界があります。脳オルガノイドの3次元(3D)in vitro 培養システムは、ヒト脳の組織と発生を再現する可能なので、ユニークな神経学的発達および疾患プロセスの研究に、ヒト脳の生理学的同様のin vitroモデルをもたらします。

脳オルガノイドは、ジカウイルス感染によって引き起こされる疾患(小頭症)、統合失調症(ASD)などのヒト脳発達および、脳・神経学的障害の研究に重要なツールとなります。

Dr. Madeline Lancaster(Lancaster protocolで培養したオルガノイドは、脳の7層構造を示す)が発表した成分に基づいて開発されたSTEMdiff Cerebral Organoid Kit)は、脳オルガノイド形成の効率を高め、最適化された培養システムおよび、より簡便なプロトコールです(図1)。

ここでは、EB形成からオルガノイド成熟まで、脳オルガノイド培養各段階の確認すべきポイントについて、ご紹介いたします。

※  STEMdiff Cerebral Organoid Kitは、ヒトES/iPS細胞由来脳オルガノイドの形成効率と再現性高い、無血清・all-in-oneキットです。

 

 

NEW:動画マニュアルが公開されました

How to Grow Cerebral Organoids(9:18)

  • 2:43 - 適切なEBの形成
  • 5:04 - 埋め込みシート(滅菌したParafilm)上のMatrigelにEBを埋め込む方法 * 
  • 5:58 - 埋め込みシート上でオルガノイドを洗浄する方法 * 
  • 6:56 - 注意深く培地交換 * 
  • 7:19 - オービタルシェイカーで振とう培養
  • 7:45 - 成長したオルガノイドの形態
  • 8:37 - 形態が良くないオルガノイドの例

*脳オルガノイドの3D培養に特に重要なポイントです

 


図1. 脳オルガノイド3D培養システムのプロトコール 概要

 

 

図2. EB 形成段階(0~5日)のプロトコール

 

EB 形成段階(0~5日)の形態

EB 形成(0~5日)での注意点:

  • Day5(EB形態確認): EB形態の確認→丸く滑らかなエッジ
  • サイズ:直径> 300 μm (typically 400 - 600 μm)

 

 

図3. 神経誘導段階(5~7日)のプロトコール

 

神経誘導段階(5~7日)の形態

神経誘導段階(5~7日)での注意点:

  • Day7(EB形態確認):神経化したEB形態の確認→光学的に半透明で滑らかなエッジ。マーカー発現:PAX6,ZO-1。

 

 

図4. 増殖段階(7~10日)のプロトコール

 

増殖段階(7~10日)のMatrigelに埋める方法

増殖段階(7~10日)での注意点:

  • Matrigelに埋める方法→滅菌したParafilmの上に細胞をMatrigelに埋めて、~30分、37度でインキュベート(30分以上、Matrigelをインキュベートしないでください)
  • Matrigelに埋める時、慎重にEBの培地(5μl培地/50μl Matrigel程度なら良い)を除去しておく(除去しないと、EBサイズが大きくなる可能性があります)

 

増殖段階(7~10日)の形態

Day10(EB形態確認):EB表面の出芽が観察され、神経上皮細胞の増殖を示す

 

 

図5. 成熟段階(10 ~ 40日+)のプロトコール

成熟段階(10~40+日)での注意点:

  • Shakingで培養(Shakingしないと、サイズが大きくなる可能性があります。またそれにより中心の細胞が死滅する可能性があります。)

 

Day 40(オルガノイド形態確認):オルガノイド形態→光学的に半透明なエッジ、稠密な組織を示す

 

脳オルガノイドのサイズ


 

 

製品リスト

製品コード

製品名

梱包単位

ST-08570

STEMdiff Cerebral Organoid Kit

Kit

ST-08571

STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit

Kit

 

 

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