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「TeSR + CloneR」ヒト多能性幹細胞(hPSC)ゲノム編集のワークフロー

[ 2018-02-26 ]

自己複製能および多分化能を持っているヒト多能性幹細胞(hPSC)は、強力な研究ツールかつ疾患モデルとして、患者細胞由来の疾患表現型および遺伝子型を再現するためによく利用されています。hPSCおよびゲノム編集(ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9)などの革新的な技術を組み合わせて、疾患モデルにおける遺伝的変異の機能的研究や広範な再生医療研究を行うことができます。

STEMCELL Technologies社のCloneRTMは、hPSCゲノム編集のシングルセルの生存率とクローニング効率(通常は1%以下、CloneRなら約20%以上)を改善し、「TeSR+CloneR」で標準的なhPSCゲノム編集プロトコールを提供します。

「TeSR+CloneR」により、ゲノム編集(genome editing)後のヒトES/iPS細胞を馴化させることなく効率よくクローニングできるので、ゲノム変異のリスクも最小限に抑えます。

 cGMP-mTeSR1の詳細はこちら>>

 CloneRの詳細はこちら>>

ZFN (Zinc-Finger Nuclease)、TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)、CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) /Cas9 (Crispr Associated protein 9)

 

「TeSR+CloneR」ゲノム編集ワークフロー

workflow

 


「TeSR+CloneR」ヒト多能性幹細胞(hPSC)のCRISPRゲノム編集

 


mTeSR1の主な特長

 
mTeSR1

 

CloneRを使うメリット

 
  • 低密度培養でのシングルセルの生存率が大幅に向上
  • シングルセル継代への馴化が不要
  • 汎用性が高く、複数の培地・マトリックス(※)に使用可能
  • 細胞株を問わず利用可能
  • ※培地はmTeSR1, TeSR-E8、マトリックスはVitronectin-XF, Laminin-521, Corning Matrigelで評価済み

CloneRに関するFAQはこちら>>

CloneR

 

 

シンプルな「TeSR+CloneR」プロトコール

TeSR_CloneR_ゲノム編集のプロトコール

 

 

 

「TeSR+CloneR」は、電気穿孔法後の回復を改善し、CRISPR編集をサポート

Fig 1. CloneRを添加したmTeSR1で培養した細胞は、ROCK inhibitor (10μM Y-27632)を加えたmTeSR1で培養した細胞に比べて電気穿孔法後の回復を改善し、CRISPR編集をサポート。いずれも24ウェルプレートに100k細胞で播種

 

 

「TeSR+CloneR」で樹立したhPSCの結果

【得られたhPSCの形態】:「TeSR+CloneR」で樹立したhPSCのコロニーサイズは、ROCKi法よりも大きい

Fig 2. CloneRを添加したmTeSR1で培養した細胞 (B) は、ROCK inhibitor (10μM Y-27632)を加えたmTeSR1で培養した細胞 (A) に比べて大きなhPSCのシングルコロニーを形成。いずれも播種後7日目の画像。

 

【得られたhPSCの未分化性】:「TeSR+CloneR」で樹立したhPSCの未分化マーカーの発現が高い

Fig 3. 「TeSR+CloneR」で樹立したH1 hES細胞株(A)およびWLS-1C hiPS細胞株(B)。どちらも親細胞株と比べて未分化マーカー(OCT4およびTRA-1-60)の発現レベルが同等。

 

【hPSCのクローニング効率】:ROCKi法より「TeSR+CloneR」で樹立したhPSCのクローニング効率が顕著

Fig 4. mTeSR1にCloneRを加えた場合(B)、ROCK inhibitor (10μM Y-27632)を加えた場合(A)に比べてヒトES/iPS細胞のクローニング効率が顕著に高くなった。12ウェルプレートにH1 ES細胞を播種し(100 cells/well, 25 cells/cm2) 、7日目にコロニーをアルカリフォスファタ-ゼ染色した様子を示す。マトリックスはVitronectin XFを使用。
 

【hPSC核型】「TeSR+CloneR」で得られたhPSCは、正常な核型を維持

Fig 5. 「TeSR+CloneR」で樹立したH1 hES細胞株(A)およびWLS-1C hiPS細胞株(B)、クローンの代表的な核図と比べて正常的な核型を示す。いずれもクローニング後第5継代の核型分析像。全継代数は、それぞれ第45および第39継代。

 

 

技術資料

 

 

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