マウス肝臓オルガノイド用培地(HepatiCult)

【製品】 NEW
HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse) (商品コード:ST-06030)は、マウスの肝前駆細胞オルガノイドを確立し、維持するための無血清完全培地です。
肝臓オルガノイド(“ミニ肝臓”)は、肝幹・前駆細胞の研究に有用なin vitro器官培養系を提供します。HepatiCultで得られたオルガノイドは、肝幹・前駆細胞 (PROM1, AXIN2, SOX9, CD44)、肝管 (KRT19 とHNF1b) および肝細胞(HNF4a, AFP)の遺伝子マーカーを発現する特徴があります。肝臓オルガノイドは、4~7日毎に継代および凍結保存する事ができ、それ以降の分化にもご利用いただけます。
HepatiCultは、Corning Matrigelドームに埋め込んだ肝臓オルガノイドの培養、および希釈したMatrigel懸濁液での肝臓オルガノイドの浮遊培養をどちらもサポートします。オルガノイドの培養は、生理学的に適切なシステムで肝上皮のin vitroでの特性評価を容易にすることで、動物の使用を減らせます。



【特長】
● 簡易な in vitro 培養系:4~5日間で肝臓オルガノイドの形成が可能
● STEP-BY-STEPなプロトコール:障害モデルや肝管のハンドピッキングおよび細胞ソーティングなど不要
● シンプルな2-コンポーネント組成:成分が明確な無血清培地
● フレキシブルなプロトコール:マトリックスドームまたは懸濁液でもオルガノイドの形成が可能

【用途】
● 肝幹細胞・胆管上皮細胞研究
● 肝細胞がん・肝疾患モデル研究
● 創薬毒性試験

【ST-06030のコンポーネント】
● HepatiCult OGM Mouse Basal Medium, 95 mL
● HepatiCult OGM Mouse Supplement, 5 mL

【プロトコール】

Fig.1 肝臓組織から肝管の単離プロトコール(Matrigelドーム法)

解剖したマウスの肝臓組織を細かく切断して、酵素消化緩衝液(EDB: Enzymatic Digestion Buffer)で消化(37度、2時間)。消化した肝管をピペッティングし、24ウェルプレートの中央の 30 - 50 μL Matrigelドームに埋め込む。ドームを37℃で10分間凝固させ、750 μL HepatiCultを加える。

【データ】
Fig.2 マウス肝前駆細胞オルガノイドは、肝管断片やシングルセルまたは、凍結オルガノイドからスタートすることが可能


HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse)(ST-06030)を用いて、(A)肝管断片(B)シングルセル(C)凍結オルガノイドからスタートし、得られた肝臓オルガノイド。初代培養7日間または解凍後継代P1(凍結オルガノイド)のイメージ。全てのオルガノイドは、Matrigelドームに埋め込んで培養。

Fig. 3 Matrigelドームまたは懸濁液でも肝臓オルガノイドの形成が可能


HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse)(ST-06030)を用いて、(A)Matrigelドーム(B)Matrigel懸濁液で培養し、得られたマウス肝管断片由来肝前駆細胞オルガノイド。いずれの培養条件で得られたオルガノイドも、4~7日以内に継代することが可能。

Fig. 4 HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse)(ST-06030) で得られたオルガノイドは、成熟した肝上皮の典型的な特徴を示す


(A)肝前駆細胞オルガノイドは、肝上皮の典型的な多角形形態を示す。
(B)オルガノイドとして培養された肝臓前駆細胞は、成熟肝細胞の共通特徴の二核形態(矢印)を示す。
(C)免疫細胞化学分析でオルガノイドの外側に沿っているMRP4(膜結合型の一方向流出輸送体)(緑)の局在化が観察できた。細胞核:DAPI(赤)。
(D)肝臓オルガノイドは、アクティブに分裂している前駆細胞ポピュレーション(Ki67遺伝子発現(赤))を含む。核酸染色:DAPI(青)

Fig. 5 Matrigelドームおよび懸濁液で培養したオルガノイドの遺伝子発現解析



HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse)(ST-06030)を用いて、MatrigelドームおよびMatrigel懸濁液で得られたオルガノイドのRNA-seqでのマーカー発現解析。いずれも肝幹・前駆細胞の関連するマーカーを発現。オルガノイドは、胆管細胞および肝細胞を含む成熟肝細胞型に関連する遺伝子を低レベルに発現。MatrigelドームおよびMatrigelのカラムは、継代における生物学的反復(継代数P1~40)。

Fig. 6 HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse)(ST-06030) で得られたオルガノイドの増殖

HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse)(ST-06030) で培養したオルガノイドは、継代培養でも効率的な増殖を示す。平均1:25(オルガノイド:培地)で継代した。

Fig. 7 肝前駆細胞オルガノイドの分化


HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse)(ST-06030) で培養されたオルガノイド(EM)は、分化培地(DM)に切り替えると、より成熟細胞型へ分化。分化培地に切り替えた後の肝臓オルガノイドは、成熟肝臓のマーカー(A) Hnf4α(B) Albおよび胆管マーカー(E) Krt19(F) Hnf1βが発現上昇、肝幹・前駆細胞マーカー(C) Sox9(D) Axin2が発現低下。
各マーカーの相対定量(RQ)は、報告された18SおよびTBPハウスキーピング遺伝子で補正され、肝前駆細胞オルガノイドと比較して正規化されたデータ。(HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse)(ST-06030) を用いて、Matrigelドームで培養された)
分化培地の組成は、参考文献1,2を参照。

【参考文献】
1. Huch et al. (2013) In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. Feb 14;494(7436):247-50.

2. Broutier et al. (2016) Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. Sep;11(9):1724-43.



本製品は、「研究用」です。研究目的にのみ使用し、人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないようにご注意ください。

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技術資料

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【インタビュー】Meritxell Huch, PhD( Dr. Hans Cleversラボ)

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英語マニュアル

HepatiCult Organoid Growth Medium (Mouse)

製品情報

製品コード 製品名 梱包単位 保存温度 該当法規 MSDS マニュアル・関連資料
日本語 英語 その他
ST-06030 HepatiCult Mouse Organoid Growth Medium 1Kit 冷蔵/冷凍  
ST-07010 Aggrewell Rinsing Solution 100mL 室温  
ST-07909 Collagenase Type IV 100mL 冷凍(-20℃)  
ST-07923 Dispase (1 U/mL) 100mL 冷凍(-20℃)  
ST-27250 37μm Reversible Strainer (For 50mL Tube) 25個 室温  
ST-36254 DMEM/F-12 with 15 mM HEPES 500mL 冷蔵(2-8℃)  
ST-37350 D-PBS without Ca++ & Mg++ 500mL 室温  
ST-70932 Mouse Hepatic Organoids 2culturewells 液体窒素  

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