ヒトES/iPS細胞の3胚葉分化能評価キット (STEMdiff Trilineage)

【製品】
STEMdiff Trilineage Differentiation Kit (ST-05230) は、既存あるいは新規に樹立されたES/iPS細胞株の3胚葉(外胚葉、中胚葉、内胚葉)への分化能を評価するための、簡便なアッセイキットです。キットに含まれる完全培地とモノレイヤー培養プロトコールによって、一週間以内に再現性良く多能性を評価します。研究室で維持している細胞株や、新たに樹立した細胞株の品質管理を簡便に行えます。

従来のテラトーマアッセイやEB法に代わる、低コストで信頼性の高いアッセイとしてご利用ください。あるいは、本製品をスクリーニングとして使用し、従来法で詳細な確認を行うことも可能です。

(ご案内) 
STEMdiff Trilineage Differentiation Kit多能性評価用キットですので、得られた細胞をさらに分化させたり、他のアプリケーションに使用することは推奨いたしません。
mTeSR 1で維持された細胞で性能検証済みです。

【特長】
● 複数の多能性幹細胞株で、再現性の高い分化を確認済み
● 各胚葉別に分化させるため、結果の解釈が容易 ※
● Definedな組成の完全培地
● 1週間で完了するプロトコール
● 分化後は様々なアッセイに使用可能(フローサイトメトリー、免疫染色、遺伝子解析)

 ※ 3胚葉を同時に分化させるEB法では、細胞株によって分化しやすい胚葉が優先的に分化してしまい、結果の解釈が難しいことがあります。データは、下の「3胚葉分化の確認(EB法との結果比較)」も参照ください。


アッセイのスキーム
STEMdiff Trilineage Differentiation Kit アッセイのスキーム
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【キット内容】
● STEMdiff Trilineage Ectoderm Medium, 175 mL
● STEMdiff Trilineage Mesoderm Medium, 100 mL
● STEMdiff Trilineage Endoderm Medium, 100 mL
    ※ 各胚葉につき、24ウェルプレート1枚分の培養が可能です。
    ※ Y-27632を別途ご用意ください。



本製品は、「研究用」です。研究目的にのみ使用し、人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないようにご注意ください。

3胚葉分化の確認(フローサイトメトリー)

H9株をSTEMdiff Trilineage Differentiation Kitで分化させフローサイトメトリーで解析したところ、lineage-specific markerがダブルポジティブとなり各胚葉への分化が確認された。

ヒトES細胞株を各胚葉に分化させ、免疫染色した例

左: Ectoderm(外胚葉) - 赤:Pax6、緑:Nestin
中央: Mesoderm(中胚葉) - 赤:T、緑:NCAM
右: Endoderm(内胚葉) - 赤:Sox17、緑:Foxa2

3胚葉分化の確認(EB法との結果比較)

H9株をSTEMdiff Trilineage Differentiation KitおよびEB法(血清入り培地、10日間培養)で分化させ、マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析を行った。EB法に比べ、STEMdiffでは胚葉特異的マーカーの発現上昇が明確に確認できた。

【文献】
● Ward E et al. Stem cells and development 2017 MAY. Feeder-Free Derivation of Naïve Human Pluripotent Stem Cells.

参考プロトコル 【FACS/フローサイトメトリーによる3胚葉分化確認】
Recovering single cells for flow cytometry analysis
The following are instructions for harvesting cells from 1 well of a 24-well plate. If using other cultureware, adjust volumes accordingly.
1.     Warm ACCUTASE™ to room temperature (15 - 25°C).
2.     Aliquot 1 - 2 mL of FACS Buffer (PBS + 2% FBS) into tubes that will be used for collecting cells.
3.     Aspirate medium from well. Wash well once with 1 mL D-PBS Without Ca++ and Mg++. Discard the wash.
4.     Add 0.5 mL ACCUTASE™ per well. Incubate at 37°C for 8 - 10 minutes.
5.     Harvest cells using a 1 mL micropipette, pipetting up and down over the growth surface to break up cellular aggregates and obtain single cells.
6.     Transfer the single-cell suspension into tubes containing FACS Buffer. Rinse wells with an additional 0.5 mL of FACS Buffer and add the rinse to the tube containing the cells.
7.     Centrifuge at 300 x g for 5 minutes.
8.     Pour off and discard the supernatant. Resuspend cells in FACS Buffer.
9.     Count viable cells using Trypan Blue and a hemocytometer. The single-cell suspension may now be used for flow cytometry analysis of choice.
 
Flow cytometry labeling protocols
1.     Warm sufficient volumes of 4% paraformaldehyde (PFA) Solution, Saponin Buffer (1 mg/mL saponin in PBS + 1% BSA), and FACS Buffer (PBS + 2% FBS) to room temperature (15 - 25°C).
2.     Centrifuge cells at 300 x g for 5 minutes. Pour off and discard the supernatant.
3.     Resuspend cells in ~1 mL 4% PFA Solution. Incubate at room temperature (15 - 25°C) for 15 minutes.
4.     Add 2 - 3 mL FACS Buffer to the tubes containing cells. Centrifuge at 300 x g for 5 minutes. Pour off and discard the supernatant.
5.     Resuspend cells in FACS Buffer at the desired concentration; the fixed cells are now ready for labeling.
6.     NOTE: Fixed cells can be kept at 2 - 8°C for up to 4 days prior to labeling.
7.     Aliquot approximately 3 x 10^5 cells per sample into a 5 mL FACS tube.
NOTE: Samples requiring intracellular antigen labeling only (e.g. Ectoderm) can be set aside on ice or at 2 - 8°C. Proceed to step 12 for labeling these samples.
8.     For samples requiring cell surface antigen labeling, centrifuge each sample of fixed cells at 300 x g for 5 minutes.
9.     During centrifugation, prepare antibody solutions for labeling of cell surface antigens (CXCR4 or NCAM) and corresponding controls in FACS Buffer with a volume of 100 μL per sample.
10.  Pour off and discard the supernatant. Resuspend samples in 100 μL of the appropriate antibody solution (prepared in step 9).
11.  Incubate samples in the dark at room temperature (15 - 25°C) for 30 - 60 minutes.
12.  Add 1 mL FACS Buffer to each labeled sample.
13.  Centrifuge all samples (labeled samples as well as samples set aside in step 6) at 300 x g for 5 minutes. Pour off and discard the supernatant.
14.  Add 1 mL of Saponin Buffer to each sample. Incubate at room temperature (15 - 25°C) for 15 minutes to permeabilize cells.
15.  Centrifuge all samples at 300 x g for 5 minutes.
16.  During centrifugation, prepare antibody solutions for labeling of intracellular antigens (PAX6 + Nestin, T, SOX17) and corresponding controls in Saponin Buffer with a volume of 100 μL per sample.
17.  Pour off and discard the supernatant. Resuspend samples in 100 μL of the appropriate antibody solution (prepared in step 16).
18.  Incubate samples in the dark at room temperature (15 - 25°C) for 30 - 60 minutes.
19.  Add 1 mL Saponin Buffer to each labeled sample.
20.  Centrifuge all samples at 300 x g for 5 minutes. Pour off and discard the supernatant.
21.  Resuspend samples in FACS Buffer for analysis on the flow cytometer.

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フライヤー

STEMdiff Trilineage英語フライヤー

よくある質問

STEMdiff TrilineageのFAQ

英語マニュアル

STEMdiff Trilineageの英語プロトコール

製品情報

製品コード 製品名 梱包単位 保存温度 該当法規 MSDS マニュアル・関連資料
日本語 英語 その他
ST-05230 STEMdiff Trilineage differentiation kit kit 冷凍(-20℃)  

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